單細胞測序鑒定復發(fā)性多發(fā)性骨髓瘤患者的耐藥途徑和治療靶點

期刊：Nature medicine
影響因子：82.9

導語
多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種腫瘤性漿細胞病變，是惡性漿細胞的克隆性增殖擁有的屬性。盡管已經(jīng)進行了廣泛的研究，但耐藥患者內部和之間的疾病異質性特征不明顯。在本研究中，進行單臂臨床試驗(nct04065789) ，結合單細胞縱向 RNA測序(scRNA-seq)來研究 MM 耐藥機制的分子動力學。新診斷的 MM 患者(41例) ，在使用含硼替佐米的方案后無效或經(jīng)歷了早期復發(fā)，被納入研究對象，評估達拉圖姆單抗、卡非利布、來那度胺和地塞米松聯(lián)合使用的安全性和有效性。通過對41例原發(fā)性難治和早期復發(fā)患者(11例健康者和15例初診 MM 患者)的數(shù)據(jù)分析，揭示了新的 MM 分子耐受途徑，包括耐缺氧、蛋白質折疊和線粒體呼吸，這些途徑在臨床上具有廣泛的代表性。作者發(fā)現(xiàn)肽基脯氨酰異構酶(PPIA)是蛋白質折疊反應途徑中的一個中心酶，是抗性 MM 的一個潛在的新靶點。Crispr-cas9缺失或應用小分子抑制劑(環(huán)孢素)抑制 PPIA 能顯著增強 MM 腫瘤細胞對蛋白酶體抑制劑的敏感性�？傊�，該研究為臨床試驗整合 scRNA-seq 制定了路線圖，確定了高耐藥 MM 患者的特征，并發(fā)現(xiàn) PPIA 是這些腫瘤的有效治療靶點。

研究技術
單細胞RNA-seq（MARS-seq）

研究路線

研究結果
1. NDMM和PRMM患者的轉錄組特征比較分析
通過對受試者骨髓中的漿細胞進行單細胞RNA測序，質控后剩余51,297個細胞。作者將這些細胞劃分成不同狀態(tài)的細胞亞群，其中包括健康的漿細胞、NDMM患者以及治療前和治療后的PRMM患者（圖2a）。漿細胞的標記基因如XBP1、MZB1、SDC1（CD138）和TNFRSF17（BCMA）在包括健康細胞的所有亞群中具有不同程度的表達（圖2b）。此外，大多數(shù)患者中都存在一些看似健康的多克隆漿細胞，這些細胞在PRMM患者中存在更高的異質性（圖2c）。單細胞轉錄組圖譜顯示，盡管每個患者都表現(xiàn)出獨特的轉錄特征，但驅動基因如CCND1、CCND2和FRZB27在PRMM和NDMM患者中均有高表達，兩組患者之間惡性漿細胞的驅動基因沒有顯著差異，因此推斷這些基因并非是造成耐藥性的分子因素（圖2d-e）。
 

2. 難治性和耐藥MM患者的應激通路分析
通過Bootstrapping量化了NDMM、PRMM和健康對照組之間漿細胞的基因表達，在NDMM和PRMM患者的惡性漿細胞中共鑒定出66個差異基因，它們聚類形成了3個模塊，可以區(qū)分NDMM和PRMM的惡性漿細胞，并將PRMM分成group1和group2兩組（圖3a）。

模塊1中的基因包括一些已被報道的MM高危因子，如STMN1、PSMB4、RRM2和TYMS，以及新鑒定到的基因PPIA。模塊1中存在幾個高度富集的特定的通路，包括線粒體應激基因COX6C、COX7A2、ER和UPR通路基因PPIA、STMN1、氧化應激基因SOD1、TXN以及蛋白酶體通路基因PSMB4和PSMA2（圖3）。這些難治性和耐藥MM患者具有的獨特應激通路可能與MM的耐藥性相關。
 

3. PRMM患者的特征可以預測對DARA–KRD治療
在臨床試驗中，41例PRMM患者接受了KYDAR藥物治療方案，這是一種高效的抗骨髓瘤四聯(lián)藥物方案，結果顯示治療效果在部分響應（PR）及以上的患者生存期顯著延長（圖4a-b）。67%的KYDAR參與者表現(xiàn)出高風險的細胞遺傳學畸變，后續(xù)通過FISH檢測評估了遺傳畸變對患者預后的影響，結果顯示具有大于一個畸變的患者生存期更短（圖4c-d）。

分析發(fā)現(xiàn)了區(qū)分PRMM隊列和NDMM患者的分子特征是與患者的預后相關，模塊1基因表達更高的分組患者的生存期更短（圖4e-f），說明這些分子特征與預后相關。綜合遺傳畸變和基因模塊分子特征兩個元素的多元模型可以更好地對藥物響應情況進行預測（圖4g-h）。
 

4. 廣泛耐藥MM患者的分子途徑
作者比較了KYDAR治療有應答患者和無應答患者之間的差異表達基因，發(fā)現(xiàn)了可以分為兩個主要簇的133個差異基因，可用于區(qū)分應答患者組和無應答患者組（圖5a）。這些差異基因集中在上調基因與免疫調節(jié)、蛋白酶體、凋亡和內質網(wǎng)應激途徑，可能與耐藥相關（圖5b-c）。分析顯示無應答患者的特征基因在很大程度上與模塊1所處位置重疊，表明這兩組基因集和對應患者之間存在高度重疊（圖5d）。
 

5. PPIA是MM患者的一個新靶點，具有廣泛的耐藥性機制。
PPIA編碼親環(huán)素A（Cyclophilin A），是一種參與蛋白質折疊通路的酶。研究人員通過單細胞轉錄組發(fā)現(xiàn)PPIA在PRMM（圖3a-b）和KYDAR無反應患者（圖5a-b）中均存在高表達，為了驗證PPIA是高耐藥患者的標志物，還是作為潛在的耐藥基因參與了MM耐藥的分子機制，研究人員在MM惡性細胞系（RPMI- 8226）中通過CRISPR敲除了PPIA并進行了耐藥實驗。實驗結果表明敲除PPIA或加入親環(huán)素A的小分子抑制劑CsA，都可以提高MM細胞對蛋白酶體抑制劑CFZ的敏感性（圖7a-b）。在誘導MM細胞凋亡中的作用，與CFZ或CsA單藥治療相比，聯(lián)合治療組的細胞凋亡顯著增加（圖7c-d）。

接下來，作者對CFZ、CsA處理后4、8小時的組合進行了scRNA-seq分析，富集得到了7個細胞亞群（圖7e-f）。發(fā)現(xiàn)響應藥物處理的細胞中與內質網(wǎng)應激反應（如ATF3, ATF4, BAG3）和凋亡通路相關的基因（如DEDD2, DDIT4, GAS5）表達上調，而代謝相關的管家基因（如LDHA）則發(fā)生表達下調（圖7g）。與單獨使用CFZ相比，CFZ+CsA聯(lián)合處理的細胞基因表達水平變化更為顯著，幾乎所有的細胞都達到了凋亡階段，通過MM患者惡性漿細胞進行的驗證也得到了一致的結果（圖7h-i），證明二者具有協(xié)同作用。進一步明確細胞對CFZ的響應和CFZ+CsA協(xié)同響應的分子機制綜上所述，研究人員證明了PPIA確實參與到MM的耐藥過程中，且親環(huán)素A抑制劑可以協(xié)同克服MM細胞對于蛋白酶體抑制劑的耐藥性。
 

總結
本文通過將單細胞轉錄組分析和臨床試驗相結合，確定了高耐藥性MM患者的分子特征，發(fā)現(xiàn)了多項與MM患者耐藥相關的機制，包括蛋白酶體機制、線粒體應激、內質網(wǎng)應激和蛋白質折疊通路，并找到了新的潛在藥用靶點PPIA，提供了PPIA抑制劑可以和其它藥物聯(lián)用治療耐藥性MM的新思路。

參考文獻：
Cohen Y C , Zada M , Wang S Y ,et al.Identification of resistance pathways and therapeutic targets in relapsed multiple myeloma patients through single-cell sequencing[J].Nature Medicine, 2021, 27(3).DOI:10.1038/s41591-021-01232-w.