免疫組化染色技術(shù)（IHC實驗）

1.免疫組織化學(xué)(IHC) 概念
免疫組織化學(xué)(IHC) 是一種利用抗原抗體特異性結(jié)合，鑒定組織切片內(nèi)特定抗原的方法。通過用一種可以被觀察到的物質(zhì)標(biāo)記抗體，抗體與熒光標(biāo)記物或酶結(jié)合，然后進行比色檢測，從而在光學(xué)顯微鏡水平上檢測抗原-抗體相互作用。
 
2.免疫組織化學(xué)(IHC) 原理
 
免疫組織化學(xué)是組織細胞中抗原(多肽和蛋白質(zhì))的定位、定性和定量研究，利用免疫學(xué)的基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性相結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子和同位素)顯色。  
3.免疫組織化學(xué)(IHC)的應(yīng)用
免疫組織化學(xué) (IHC)，利用單克隆和多克隆抗體檢測組織切片中的特定抗原，是診斷性外科病理學(xué)家的武器庫中非常強大的工具。IHC 是單克隆抗體和多克隆抗體的一項重要應(yīng)用，可用于確定目標(biāo)抗原在健康和疾病中的組織分布。

 
4.免疫組化主要流程
免疫組化染色技術(shù)的主要流程如下：樣品制備，固定，組織切片，石蠟包埋，滅活和阻斷，抗原修復(fù)，檢測。
 
4.1樣品制備
樣本采集和制備在 IHC 中起著重要作用，因為抗原的展示和定位在很大程度上取決于組織樣本的質(zhì)量。
4.1.1細胞樣本：有貼壁細胞和非貼壁細胞
4.1.2組織樣本：組織樣本通常取自各種來源的標(biāo)本：活檢、手術(shù)、動物模型和尸檢。前三種標(biāo)本提供新鮮組織，而最后一種（尸檢）是在動物死亡兩個小時后采集的，這或多或少會死后自溶。
4.2固定
4.2.1固定液的選擇
丙酮、酒精、醛、非醛類，需要測試固定液是否適合抗原。
4.2.2方法和時間
（1）浸泡法是活檢和手術(shù)標(biāo)本以及其他非沖洗組織通常采用這種固定方法。
（2）灌溉法是動物實驗中的一種選擇方法
（3）固定時間取決于組織厚度、溶液濃度和實驗溫度。原則上，時間與組織厚度成正比，與溶液濃度成反比。
 
4.3組織切片
4.3.1顯微載玻片：由于表面附著油污，應(yīng)將新載玻片浸入清潔液中 12 至 24 小時。用蒸餾水清洗載玻片 5 次以上后，將其浸入 95% 的酒精中 2 小時，然后通過簡單擦拭或在紅外線烘箱中干燥。洗滌時注意避免劃傷載玻片。
4.3.2蓋玻片：蓋玻片預(yù)處理程序與顯微鏡載玻片非常相似，只是浸漬和清潔可以在 2 小時內(nèi)完成，因為蓋玻片要薄得多。
4.3.3組織切片封片
4.3.3.1用丙酮稀釋 3-氨基丙基三乙氧基硅烷 (APES)
4.3.3.2用 APES 涂上顯微鏡載玻片
4.3.3.3在涂層載玻片上涂抹紙巾，然后在紙巾上滴一滴封固劑（甘油明膠）
4.3.3.4將蓋玻片保持在 45°，讓液滴沿著玻片的邊緣擴散
4.3.3.5慢慢地用蓋玻片完全覆蓋組織
4.3.3.6如果組織切片有粘附問題，將玻片在 80℃ 孵育 1 小時
 
4.4石蠟包埋
石蠟包埋有五個主要步驟：固定、脫水、透明化、浸漬和包埋。
4.4.1固定：參考如上固定方法
4.4.2脫水：完全去除水分，為下一步創(chuàng)造條件并硬化組織，常用脫水劑是乙醇和丙酮。脫水劑與水完全混溶并且可以與水以不同的體積比制備。
4.4.3透明化：脫水后，組織需要透明化，因為上一步中使用的脫水劑與后續(xù)步驟之一的石蠟不混溶。添加透明試劑有助于石蠟吸收到組織中。
4.4.4浸沒：透明化后，可將薄紙浸入熔化的石蠟中，使其吸附蠟透明劑。根據(jù)蠟的熔點，浸泡應(yīng)在54-64℃進行。
4.4.5包埋：這是在石蠟盒中處理組織，使石蠟冷卻并凝固的過程。以乙醇和二甲苯進行處理。 4.5滅活和阻斷
4.5.1滅活
當(dāng)辣根過氧化物酶 (HRP) 或堿性磷酸酶 (AP) 系統(tǒng)應(yīng)用于 IHC 時，應(yīng)阻斷或抑制內(nèi)源性酶的激活，以避免產(chǎn)生非特異性結(jié)合。
4.5.1.1內(nèi)源性 HRP 滅活
（1）將石蠟包埋切片在 3% H₂O₂ 中孵育 10 分鐘。
（2）在甲醇和 3% H₂O2（v/v：4:1）組成的溶液中孵育冰凍切片或細胞切片 30 分鐘。
4.5.1.2內(nèi)源性 AP 失活
（1）在 0.1 mM 左旋咪唑中孵育樣品。
4.5.2阻斷
組織切片上的殘留位點可能會與二抗結(jié)合并產(chǎn)生假陽性結(jié)果，因此，通常使用與二抗相同物種的血清進行封閉。
 
4.6抗原修復(fù)
甲醛固定通常會產(chǎn)生亞甲基橋，它會交聯(lián)蛋白質(zhì)，從而掩蓋目標(biāo)的表位。必須通過加熱（熱誘導(dǎo)表位檢索：HIER）或酶消化（蛋白水解誘導(dǎo)表位檢索：PIER）來暴露抗原表位，以便讓抗體結(jié)合。
 
4.7檢測
IHC 檢測方法因分析報告的性質(zhì)和結(jié)合化學(xué)等因素而異。一般使用三種方法：免疫熒光法 (IF)、酶法和親和法。以熒光法為例介紹實驗步驟：
4.7.1免疫熒光法
4.7.1.1初染
（1）將樣品貼在載玻片上（為確保熒光染色的有效性，應(yīng)進行陽性、陰性和樣品自發(fā)熒光對照，以確認沒有非特異性結(jié)合。）
（2）加入適當(dāng)稀釋的一抗覆蓋樣品
（3）將載玻片放入濕盒中，37℃孵育1-2小時
（4）用 0.01 M PBS (pH 7.4) 清洗載玻片 3 次，每次 5 分鐘
（5）去除樣品上多余的水（但要保持濕潤）
（6）用適當(dāng)稀釋的二抗覆蓋樣品
（7）將載玻片放入濕盒中，37℃孵育30-60分鐘
（8）用 0.01 M PBS (pH 7.4) 清洗載玻片 3 次，每次 5 分鐘
（9）去除樣品上多余的水（但要保持濕潤）
（10）向樣品中加入緩沖甘油（封固劑）并用蓋玻片封固
（11）在熒光顯微鏡下觀察蓋玻片
4.7.1.2復(fù)染
熒光染色后，應(yīng)進行復(fù)染，使細胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，特異性熒光更易觀察。常用的復(fù)染熒光染料是：DAPI 、Hoechst 3、碘化丙錠。
  4.7.2染色樣品儲存
染色后，樣品應(yīng)立即在熒光顯微鏡下觀察和成像。如果不立即拍攝圖像，應(yīng)將它們安裝在緩沖甘油介質(zhì)中，并在 4℃ 下保存不超過一周。如果將抗熒光衰減介質(zhì)應(yīng)用于樣品，熒光信號可能不會在一個月內(nèi)顯著衰減。