飛納 Pharos-STEM 在細胞生物學和病理學的應用
一直以來，透射電鏡（TEM）是觀察和研究超微結構的首選工具，可用于觀察整個細胞結構，包括細胞壁、細胞膜、細胞核和各種細胞器的變化，以及外源物質(zhì)與細胞之間的關系等。不僅有助于許多重要細胞器的結構和功能的研究，而且有助于解剖病理學、血液學和微生物學等學科的病理診斷研究。
掃描透射（STEM）模式作為 TEM 的附加配件，可以顯著提高生物樣品的襯度，特別是未染色的組織切片。應對此類生物樣品，TEM 操作人員通常也會選擇相對較低的加速電壓（80kV）來增加圖像的襯度，并提高清晰度。但是由于其操作的復雜性，在對細胞生物學和病理學的超微結構的研究中，還沒有被廣泛應用（除專業(yè)的電鏡中心外）。
飛納臺式場發(fā)射掃描電鏡，體積小巧，具有低電壓成像的優(yōu)勢，配備了新型的掃描透射（STEM）探測器后，可以結合掃描電鏡和透射電鏡的功能特點，在 15kV 的低加速電壓下，就可以獲得高分辨率的掃描透射成像。在觀測電子束敏感的生物樣品時，可以獲得高成像質(zhì)量圖片。
掃描透射（STEM）模式作為 TEM 的附加配件，可以顯著提高生物樣品的襯度，特別是未染色的組織切片。應對此類生物樣品，TEM 操作人員通常也會選擇相對較低的加速電壓（80kV）來增加圖像的襯度，并提高清晰度。但是由于其操作的復雜性，在對細胞生物學和病理學的超微結構的研究中，還沒有被廣泛應用（除專業(yè)的電鏡中心外）。
飛納臺式場發(fā)射掃描電鏡，體積小巧，具有低電壓成像的優(yōu)勢，配備了新型的掃描透射（STEM）探測器后，可以結合掃描電鏡和透射電鏡的功能特點，在 15kV 的低加速電壓下，就可以獲得高分辨率的掃描透射成像。在觀測電子束敏感的生物樣品時，可以獲得高成像質(zhì)量圖片。
以下為大家分享生物組織樣品的制樣方法以及 4 個使用 Pharos-STEM 拍攝的案例。（加速電壓 15kV，工作距離 8.9mm）
制樣方式
對生物組織樣品進行透射電鏡成像時，制樣處理過程主要包括固定、脫水處理、樹脂浸潤和干燥、切片。
具體過程如下：使用 2.5% 的戊二醇溶液（溶解于 PH 值為 7.4 的 0.1M 碳酸鈉緩沖液中）進行固定，固定完成后，組織樣品在碳酸鈉緩沖液中清洗 1-2 天。這個過程具體包括使用 2% 四氧化餓清洗 4h，2% 醋酸鈾清洗 1h，醋酸鈉清洗 1h；然后使用梯度乙醇和丙酮進行脫水處理；接著按照標準配方使用低粘度環(huán)氧樹脂 Spurr 進行包埋，將樹脂在 70℃ 下固化 15h；最后使用超微切片機制備 70nm 厚的組織切片，將組織切片安裝在 300 目的銅網(wǎng)上。接下來將具有樣品的銅網(wǎng)放入 Pharos-STEM 中進行觀測，結果如下。
案例一. 被腎小囊（Bowman's capsule）包裹的正常腎小球
圖1 小鼠腎標本樣品（腎小球和臨近的腎血管）的 STEM 圖。紅色箭頭處可以看到含有紅細胞的腎小球毛細血管，毛細血管被腎小球基底膜和足細胞的足突包圍。
圖1 為被腎小囊（Bowman's capsule）包裹的正常腎小球的超微結構。 STEM 圖顯示了正常腎小球毛細血管袢和腎小球系膜，與 TEM 下的微觀圖像類似。STEM 圖中的紅色箭頭處清晰顯示了腎小球基底膜、系膜基質(zhì)、系膜胞質(zhì)、足細胞足突的細節(jié)以及與基底膜毗鄰的裂孔結構。STEM 圖像顯示了高分辨的超微結構，圖像襯度明顯，可以快速捕捉到極小的細胞變化，并快速分析感興趣部位的微觀結構。
案例二：正常的小鼠胰腺腺泡細胞
圖2 正常的小鼠胰腺腺泡細胞結構 STEM 圖。圖中顯示了酶原顆粒（Z）、液泡、線粒體（M）、腺泡腔（L）和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（R）。上圖為胰腺星形細胞，下圖為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的精細結構。
圖 3 人類腦腫瘤組織 STEM 圖。圖中清晰顯示了細胞的超微結構特征，髓鞘軸突、線粒體和嵴結構（M）、包含細胞間質(zhì)纖維和囊泡的星形細胞結構（紅色箭頭處）。圖中可以清晰觀測到細胞結構和細胞器之間的關系。
圖 4 培養(yǎng)的全能干細胞的 STEM 圖。晶狀體上皮細胞內(nèi)有大量的細胞質(zhì)器，如線粒體和卵圓形細胞核。均質(zhì)的細胞外觀與早期細胞分化階段的細胞相似（數(shù)據(jù)來自 ROR1e LECs）。圖中可以清晰看到晶狀體的微結構，包括靠近組織周圍的晶狀體上皮細胞，以及與之相鄰的具有桿狀細胞核的未成熟的晶狀體纖維細胞，具有圓形細胞核的細胞和晶狀體纖維細胞類似。
通過以上 4 個案例，可以看出，使用配備 STEM 探測器的飛納臺式場發(fā)射掃描電鏡，在觀察生物類樣品時，在較低的加速電壓下，幾分鐘內(nèi)便可以獲得高襯度、高分辨圖像。
參考文獻
案例三. 人類腦腫瘤組織
圖 3 人類腦腫瘤組織 STEM 圖。圖中清晰顯示了細胞的超微結構特征，髓鞘軸突、線粒體和嵴結構（M）、包含細胞間質(zhì)纖維和囊泡的星形細胞結構（紅色箭頭處）。圖中可以清晰觀測到細胞結構和細胞器之間的關系。
圖 4 培養(yǎng)的全能干細胞的 STEM 圖。晶狀體上皮細胞內(nèi)有大量的細胞質(zhì)器，如線粒體和卵圓形細胞核。均質(zhì)的細胞外觀與早期細胞分化階段的細胞相似（數(shù)據(jù)來自 ROR1e LECs）。圖中可以清晰看到晶狀體的微結構，包括靠近組織周圍的晶狀體上皮細胞，以及與之相鄰的具有桿狀細胞核的未成熟的晶狀體纖維細胞，具有圓形細胞核的細胞和晶狀體纖維細胞類似。
通過以上 4 個案例，可以看出，使用配備 STEM 探測器的飛納臺式場發(fā)射掃描電鏡，在觀察生物類樣品時，在較低的加速電壓下，幾分鐘內(nèi)便可以獲得高襯度、高分辨圖像。
參考文獻
- Cohen Hyams T; Mam K; Killingsworth MC, 2020, ‘Scanning electron microscopy as a new tool for diagnostic pathology and cell biology’, Micron, vol. 130, pp. 102797 -102797, http://dx.doi.org/10.1016/j.micron.2019.102797.
- C. U., Devi, M. Masona, T. Cohen Hyams, M. C. Killingsworth, D. G. Harmana V. Gnanasambandapillai, L. Liyanage and M. D. O’Connor, ‘A simplified method for producing human lens epithelial cells and light-focusing micro-lenses from pluripotent stem cells’, Experimental Eye Research (2020) https://doi.org/10.1016/j.exer.2020.108317
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