我們辛辛苦苦養(yǎng)好的類器官,該如何做鑒定呢?通常是HE染色和免疫組化染色。今天小編帶大家了解一下類器官如何進(jìn)行包埋及HE染色。
一、類器官收集
1、類器官收集(例如24孔板,收集1-2孔類器官,大約200-500個類器官);
2、4℃靜置 10min,離心棄去大部分上清。
二、瓊脂糖凹槽制備
1、稱量0.2至0.4g瓊脂糖,加入至燒杯或者小試劑瓶內(nèi);
2、加入10mL左右PBS;
3、微波爐高火融化,每隔5s暫停打開,觀察,重復(fù)數(shù)次至瓊脂糖融化完全;
4、取約200uL融化瓊脂糖,加入至600uL 1.5ml EP管內(nèi)(如下圖所示);
5、在盛有瓊脂糖的1.5ml EP管內(nèi)插入一小0.5ml EP管,使瓊脂糖形成一圓尖底凹槽,室溫或者4℃冰箱靜置數(shù)分鐘,至瓊脂糖凝固,輕輕轉(zhuǎn)動小0.5ml EP管,取出0.5ml EP管,可看到瓊脂糖內(nèi)形成一個深圓尖底槽;
6、吸取類器官沉淀置于凹槽底部,盡量包埋在中間位置;
7、加入PBS至高于瓊脂糖槽的邊緣。
三、類器官固定
四、類器官包埋
1、脫水:取出已凝固的含有類器官沉淀的瓊脂糖塊,在梯度乙醇中脫水,70%、80%、90%和95%乙醇各1h,100%乙醇30min,待其凝固;
2、融蠟:提前4h左右打開烘箱,65℃溶蠟;
3、透明:將脫水完成后的瓊脂糖塊轉(zhuǎn)移至組織包埋盒中(二甲苯處理前需一直浸泡在無水乙醇中),將包埋盒轉(zhuǎn)移至二甲苯中5min處理兩次;注:因二甲苯有毒性,需在通風(fēng)良好區(qū)域進(jìn)行操作,取出時盡量瀝盡殘留二甲苯;
4、浸蠟:透明化處理完成后立即轉(zhuǎn)入已經(jīng)融化的蠟缸中,60℃浸蠟2h后,更換新的蠟缸再次浸蠟2h;
5、包埋:包埋在冰盒上進(jìn)行,將融好的純蠟倒入蠟盒三分之一處,將瓊脂塊放置于中間位置,然后再滴蠟包埋直到倒?jié)M。待蠟塊完全凝固后,小心脫下模具。
五、類器官HE染色
1、石蠟切片脫蠟至水
依次將切片放入二甲苯I 10min;二甲苯Ⅱ10min;無水乙醇Ⅰ5min;無水乙醇Ⅱ5min;95%酒精5min;90%酒精5min;80%酒精5min;70%酒精5min;蒸餾水洗。
2、蘇木素染細(xì)胞核
切片入Harris蘇木素染3-8min,自來水洗。
3、伊紅染細(xì)胞質(zhì)
切片入伊紅染液中染色1-3min,自來水洗。
4、脫水封片
將切片依次放入95%酒精I(xiàn) 5min ;95%酒精I(xiàn)I 5min;無水乙醇Ⅰ5min ;無水乙醇Ⅱ5min ;二甲苯Ⅰ5min ;二甲苯Ⅱ5min中脫水透明,將切片從二甲苯拿出來稍晾干,中性樹膠封片。
5、顯微鏡鏡檢,圖像采集分析
六、類器官鑒定-HE染色結(jié)果(以肺癌為例)
人肺癌類器官HE染色