線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的檢測方法全解析

線粒體是在真核細(xì)胞中由雙層高度特化的單位膜圍成的半自主性細(xì)胞器，能產(chǎn)生能量以維持細(xì)胞正常的生理活動。大量研究表明，在生物的生長、發(fā)育、代謝、衰老、疾病、死亡以及生物進(jìn)化等方面，線粒體參與其中進(jìn)行調(diào)控或信號傳導(dǎo)，且還參與細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)、活性氧（ROS）的產(chǎn)生以及細(xì)胞色素C的釋放[1]。關(guān)于線粒體的研究在近十年來仍呈爆發(fā)式增長，也是近年來高分文章的焦點(diǎn)之一。

圖1 Ca2+和ROS/RNS在線粒體能量產(chǎn)生中的作用[1]。

 

目前文獻(xiàn)中對于線粒體的研究主要有兩個方面：一是形態(tài)結(jié)構(gòu)的檢測；二是線粒體功能的檢測及分析。

 

線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)的檢測

 

電子顯微鏡（electron microscope, EM）技術(shù)是觀察和分析線粒體結(jié)構(gòu)的金指標(biāo)。其中，透射電子顯微鏡是線粒體形態(tài)學(xué)檢查的有力工具，也是觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)及其相關(guān)基因突變或生理條件引起的變化、線粒體與其他細(xì)胞膜（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或質(zhì)膜）間相互作用的必要方法。此外，由于特異性強(qiáng)，免疫電鏡已成為觀察線粒體相關(guān)蛋白質(zhì)定位的首選方法。

 

線粒體功能的檢測及分析

 

線粒體形態(tài)和功能密切相關(guān)，通常線粒體伸長、呼吸或膜電位的增加與改善的線粒體功能相一致[2]。相反，活性氧（ROS）增加、線粒體鈣水平升高或線粒體斷裂可能表明功能障礙[3-4]�；罴�(xì)胞線粒體染料包括DASPEI、4-Di-1-ASP等，對于線粒體功能的檢測及分析可以從以下幾個方面探究。

 

線粒體Ca2+ 測定

 

鈣（Ca2+）在許多生物系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、血液凝固、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、酶的激活和細(xì)胞分裂等方面。線粒體Ca2+ 被稱為氧化磷酸化的中心調(diào)節(jié)劑，在細(xì)胞內(nèi)，鈣離子主要儲存在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中，Ca2+ 在調(diào)節(jié)線粒體代謝、保持細(xì)胞所需的線粒體ATP產(chǎn)量、通過ATP合成酶的磷酸化在ADP中發(fā)揮著重要作用。熒光探針Fluo 3-AM和Fluo 4-AM可以測量線粒體中的鈣含量。這種方法適用于各種活體細(xì)胞內(nèi)線粒體Ca2+ 的濃度檢測，操作簡便、性能穩(wěn)定，具有較高的靈敏性。

 

活性氧的檢測

 

正常情況下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)與氧自由基處于平衡狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的水平維持在較低的生理范圍。在病理情況下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)與氧自由基的平衡被打破，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平過多，就可破壞線粒體的酶類、脂類和核酸，使機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激，同時活性氧還可攻擊線粒體DNA產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致線粒體ATP合成減少、線粒體膜電位破壞等結(jié)構(gòu)和功能變化。因此，我們可以通過檢測活性氧的多少來測定線粒體的功能是否正常。ROS可采用熒光探針DCHF-DA染料測定；DCHF-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCHF，而DCHF不能出入細(xì)胞膜從而使探針很容易被標(biāo)記到細(xì)胞內(nèi)。在活性氧的存在下，DCHF被氧化生成熒光物質(zhì)DCF，其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比，檢測 DCF的熒光就可以知道活性氧的水平。

 

線粒體膜電位

 

線粒體內(nèi)膜兩側(cè)通常出現(xiàn)負(fù)電位差（˗180 mV~ ˗200 mV），這就是線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential, MMP, Δψm）。MMP的變化甚至微量變化，都會極大地影響線粒體的功能。線粒體功能與細(xì)胞穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，MMP的異常變化會進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體疾病。監(jiān)測MMP是評估線粒體功能狀態(tài)的常用方法。目前常用的是采用熒光染料探針方法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)來檢測線粒體膜電位。

圖2 熱應(yīng)激損傷成肌細(xì)胞線粒體的生物發(fā)生和功能[5]。

 

成肌細(xì)胞在增殖（A）和分化（B）過程中JC-1染色的代表性圖像。（C）紅色熒光與綠色熒光的比率。（D）成肌細(xì)胞增殖和分化過程中的電子顯微鏡。紅色箭頭表示線粒體（比例尺: 500 nm）。

 

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）檢測

 

線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore, MPTP）是線粒體滲透轉(zhuǎn)換功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是線粒體內(nèi)外膜結(jié)合處的一種蛋白性通道。它對細(xì)胞內(nèi)多種離子濃度變化非常敏感, 特別是對細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)有重要作用。在細(xì)胞凋亡或壞死時，線粒體內(nèi)容物通過膜通道孔釋放到胞漿中[6]。膜通道孔的開放，顯著改變了線粒體的通透性。鈣離子過度進(jìn)入、線粒體谷胱苷肽的氧化和活性氧族水平的增加等導(dǎo)致膜通道孔的持續(xù)開放，而造成細(xì)胞色素C的釋放和線粒體膜電位的消失[7]。鈣黃綠素-AM是一種活體細(xì)胞線粒體MPTP熒光檢測試劑，通過鈣黃綠素-鈷技術(shù)（聚集在線粒體內(nèi)的鈣黃綠素呈現(xiàn)熒光染色，而存在于胞漿或由線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中的熒光染料即刻發(fā)生熒光淬滅）來分析和觀察線粒體膜通道孔活性。

 

此外，對線粒體的功能研究還可以從線粒體ATP測定、線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性測定、線粒體DNA的檢測等方面進(jìn)行研究。線粒體功能檢測最全面的理想研究還應(yīng)包括其他檢測的組合，如完整分離的線粒體、透化細(xì)胞或組織中氧消耗的測量、ATP的合成、用放射性標(biāo)記的底物進(jìn)行氧化研究和測定線粒體的運(yùn)動等，并可以對線粒體的功能障礙進(jìn)行靈敏檢測。還可以通過測定線粒體的代謝物活力，如檢測丙酮酸、乳酸、乳酸脫氫酶等的水平來檢測線粒體的功能[8]。

 

參考文獻(xiàn)

[1] Castora F J .Mitochondrial function and abnormalities implicated in the pathogenesis of ASD[J].Progress in Neuro Psychopharmacology & Biological Psychiatry, 2019, 92:83-108.DOI:10.1016/j.pnpbp.2018.12.015.

[2] Gao G, Wang Z, Lu L, et al. Morphological analysis of mitochondria for evaluating the toxicity of alpha-synuclein in transgenic mice and isolated preparations by atomic force microscopy. Biomed Pharmacother, 2017, 96: 1380-1388.

[3] Ferraresi C, Kaippert B, Avci P, et al. Low-level laser (light) therapy increases mitochondrial membrane potential and ATP synthesis in C2C12 myotubes with a peak response at 3-6 h. Photochem Photobiol, 2015, 91(2): 411-416.

[4] 楊建, 高瑩, 史慧妍等.線粒體功能障礙與高血壓.中國動脈粥樣硬化雜志, 2017, 25(10): 1061-1066.

[5] Lu JW, Li HX, Yu DB, et al. Heat stress inhibits the proliferation and differentiation of myoblasts and is associated withdamage to mitochondria[J]. Frontiers in Cell and Developmental Biology,2023. 

[6] Castora FJ. Mitochondrial function and abnormalities implicated in the pathogenesis of ASD. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2019, 92: 83-108.

[7] Chen MX, Ward E, Caivano M, et al. Probing mitochondrial permeability transition pore activity in nucleated cells and platelets by high-throughput screening assays suggests involvement of protein phosphatase 2B in mitochondrial dynamics. Assay Drug Dev Technol, 2018, 16(8): 445-455.

[8]肖晨,陳思君,危當(dāng)恒,等.線粒體功能的檢測方法[J].生命的化學(xué), 2020, 40(2):8.