轉(zhuǎn)錄組測序揭示基因在產(chǎn)前PM2.5潛在作用中的應(yīng)用

期刊：Science of the Total Environment
影響因子：9.8

導(dǎo)語
世衛(wèi)組織于2021年發(fā)布了最新的空氣質(zhì)量指南，其中建議的PM2.5年度安全限值從10 μg/m3降低到5 μg/m3。PM2.5由于體積小，表面積大，可以攜帶多種有毒物質(zhì)和可以通過鼻腔和呼吸道進入肺部，最終通過肺泡內(nèi)的空氣交換對其他器官造成損害。最近的研究報道，PM2.5既可以通過胎盤直接作用于胎兒，也可以間接誘導(dǎo)胎盤的表觀遺傳修飾來影響胎兒的發(fā)育。特別是，產(chǎn)前PM2.5暴露與后代發(fā)生神經(jīng)發(fā)育障礙的風(fēng)險增加有關(guān)。例如，產(chǎn)前接觸PM2.5會導(dǎo)致后代的記憶和認知障礙，并增加了兒童患自閉癥譜系障礙和注意力缺陷/多動障礙的風(fēng)險。

研究重點
產(chǎn)前PM2.5暴露誘導(dǎo)男性后代髓磷脂發(fā)育異常。
產(chǎn)前PM2.5暴露改變了男性后代的髓鞘形成相關(guān)基因。
產(chǎn)前PM2.5暴露損害了男性后代的髓鞘超微結(jié)構(gòu)。
PM2.5通過lncrna-Ctcf信號通路干擾髓鞘的發(fā)育。

研究技術(shù)
全轉(zhuǎn)錄組測序（技術(shù)服務(wù)由伯豪生物提供）

技術(shù)路線

研究內(nèi)容
1.男性后代大腦皮層中WGCNA的mRNA轉(zhuǎn)錄譜和聚類劃分的時間序列分析
對男性后代的大腦皮層進行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)差異基因2052 個，對其進行WGCNA分析，得到5個模塊，棕色模塊（r = 0.92，p = 1e-10）與時間點呈顯著的正相關(guān)，表明在產(chǎn)前PM2.5暴露后，它受男性后代大腦發(fā)育窗口的影響最為顯著。
 

2.模塊中mRNA表達譜的富集分析
棕色模塊中有403個差異基因的富集分析顯示主要與髓鞘形成和神經(jīng)元的保護相關(guān)。髓鞘是由成熟的少突膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的，通過軸突的螺旋包裹和壓實，由內(nèi)而外地形成多層膜結(jié)構(gòu)。富集分析也在底物粘附依賴的細胞擴散中富集。提示產(chǎn)前暴露PM2.5可能會以時間序列模式中斷髓鞘結(jié)構(gòu)的發(fā)育。
 

3. 產(chǎn)前PM2.5暴露后男性后代髓鞘發(fā)育異常
首先通過RT-qPCR進行驗證Fa2h、Mal、S100b、Tppp、Trf、Abca2、Cntnap1、Eif2b5、Tnfrsf21、Tnfrsfsf1b和Sh3tc2。其中，F(xiàn)a2h、Mal、S100b和Tppp對髓鞘的正常發(fā)育至關(guān)重要，在髓鞘的建立和維持中起著重要作用。同時發(fā)現(xiàn)基因隨著時間變化有著不同變化，如Fa2h、Mal、S100b和Tppp的表達在發(fā)育后期顯著降低（PNDs 14和21）；Trf水平從PND 1到PND 21持續(xù)下降等。11個基因使用比較毒物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫（CTD），它們都參與了脫髓鞘疾病，且大多數(shù)基因的推斷得分（除Trf和Cntnap1外）的推斷得分也具有較高的相關(guān)性。髓鞘的形態(tài)學(xué)相對應(yīng)也發(fā)現(xiàn)異常。
 

4. 產(chǎn)前PM2.5暴露后，男性后代中l(wèi)ncRNA表達譜紊亂
為了鑒定可能參與髓鞘異常發(fā)育的lncRNA，我們進行了lncRNA測序（lncRNA-seq），獲得了PND 21上男性后代皮質(zhì)的lncRNA表達譜。選擇了45個lncRNA與mRNA相關(guān)性分析。有37個lncRNA與10個髓鞘化相關(guān)基因共表達，然后集中在前兩個lncRNA（NONMMUT058932.2，NONMMUT029203.2）可能與6個mRNA（Fa2h、Mal、Sh3tc2、Trf、Tppp、Eif2b5）相互作用。此外，lncRNA NONMMUT062500.2可能調(diào)控Abca2和S100b的表達，而lncRNANONMMUT034761.2和NONMMUT003638.2分別只可能與Cntnap1和Tnfrsf1b相互作用。RT-qPCR對NONMMUT058932.2和NONMMUT029203.2的表達進行了驗證，結(jié)果與lncRNA-seq數(shù)據(jù)一致。

 

5. lncrna在男性后代髓鞘形成異常中的轉(zhuǎn)錄調(diào)
由于lncRNAs通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子在基因調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，我們進一步研究了兩個lncrna之間可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。利用基于公開的小鼠神經(jīng)元ChIP-seq數(shù)據(jù)集的ChIP-Atlas預(yù)測上述6個基因的潛在TFs，包括Fa2h、Mal、Sh3tc2、Trf、Tppp和Eif2b5。根據(jù)被覆蓋基因的數(shù)量對TFs進行排序，以CCCTC結(jié)合因子（Ctcf）為最優(yōu)轉(zhuǎn)錄因子。為了驗證lncRNONMMUT029203.2和NONMMUT058932.2與Ctcf的結(jié)合能力，我們在PND 21上對男性后代的大腦皮層進行了RIP實驗。結(jié)果表明，Ctcf是NONMMUT029203.2和NONMMUT058932.2的相互作用蛋白，產(chǎn)前PM2.5暴露顯著降低了相互作用。

結(jié)論
產(chǎn)前PM2.5暴露后男性后代大腦皮質(zhì)的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果。使用two-way ANOVA和WGCNA發(fā)現(xiàn)，對神經(jīng)發(fā)育過程影響最顯著的是髓鞘的發(fā)育。lncRNA NONMMUT058932.2和NONMMUT029203.2通過減少與Ctcf的結(jié)合，調(diào)控髓鞘化相關(guān)基因（Fa2h、Mal、Sh3tc2、Trf和Tppp）的表達，在這一過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。我們的研究首次為產(chǎn)前PM2.5暴露后男性后代髓磷脂發(fā)育異常提供了轉(zhuǎn)錄水平的基因組證據(jù)。

參考文獻：

1. Hou Y, Yan W, Li G, Sang N. Transcriptome sequencing analysis reveals a potential role of lncRNA NONMMUT058932.2 and NONMMUT029203.2 in abnormal myelin development of male offspring following prenatal PM2.5 exposure. Sci Total Environ. 2023 Jun 20;895:165004.doi:10.1016/j.scitotenv.2023.165004. Epub ahead of print. PMID: 37348736.