利用ATP生物發(fā)光技術(shù)進(jìn)行類器官藥敏活性檢測的方法

類器官在藥敏藥篩這塊的活力檢測方法采用ATP生物發(fā)光技術(shù)的方法相對其它方法更簡便，更準(zhǔn)確。小愛帶您了解一下檢測方法吧。

1、ATP生物發(fā)光技術(shù)原理

在類器官細(xì)胞培養(yǎng)物中加入相應(yīng)試劑使類器官裂解，釋放ATP，熒光素酶催化底物熒光素的轉(zhuǎn)化，高效利用ATP的能量，發(fā)射光子形成光信號。發(fā)光強(qiáng)度與ATP在一定范圍內(nèi)成正比，而ATP又與活細(xì)胞數(shù)目又呈正比，因此可以對類器官活細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行定量檢測。

2、類器官ATP生物發(fā)光方法

使用適合進(jìn)行發(fā)光檢測的24孔板，每孔接種類器官與基質(zhì)膠混合物25ul平鋪到孔底部，同時設(shè)置不含類器官的基質(zhì)膠與培養(yǎng)液孔作為陰性對照，按照類器官培養(yǎng)的常規(guī)方法培養(yǎng)類器官。如有需要，可加入藥物處理類器官。此外，如有必要也可以設(shè)置類器官的濃度梯度，以便后續(xù)確定試劑盒的使用效果。

（2）試劑準(zhǔn)備

a. 融化：將ATP活性檢測試劑盒置于2~8℃或室溫條件下融化；
b. 使用前輕柔顛倒幾次使溶液混合均勻。

（3）檢測步驟

a. 于培養(yǎng)箱中取出待測類器官培養(yǎng)板，室溫放置30min，以使培養(yǎng)板溫度平衡至室溫；
b. 加入與待測類器官培養(yǎng)物等體積并平衡至室溫的緩沖液(abs9730)。例如，使用24孔培養(yǎng)板時，先去除類器官培養(yǎng)基，用類器官緩沖液置換靜置清洗3次，然后吸取25μl本品加入25μl待測類器官培養(yǎng)物中（加入體積與基質(zhì)膠團(tuán)混合物體積一致）；
c. 劇烈振蕩5min使類器官充分裂解；室溫放置25min以穩(wěn)定發(fā)光信號，即可進(jìn)行檢測；
d. 使用具有檢測化學(xué)發(fā)光功能的多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測。請根據(jù)儀器要求設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，每個孔的檢測時間一般為0.25-1s或更長時間，具體需根據(jù)儀器的檢測靈敏度進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整；
e. 根據(jù)化學(xué)發(fā)光讀數(shù)直接計算類器官的相對活力，或根據(jù)ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出ATP的量從而計算出類器官細(xì)胞的相對活力。類器官在0-30個類器官/孔的類器官密度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，ATP標(biāo)準(zhǔn)品0-10,000nM濃度范圍有良好的線性關(guān)系；

注：檢測效果因類器官的種類不同而有所不同，對于一些ATP含量特別高的類器官，在類器官數(shù)量達(dá)到100個后可能會不呈現(xiàn)線性相關(guān)，但化學(xué)發(fā)光讀數(shù)還是會繼續(xù)升高的。

（4）ATP 標(biāo)準(zhǔn)曲線的設(shè)置（選做）：

把自備的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液用PBS或類器官培養(yǎng)液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻�。初次檢測可以設(shè)置0、10、30、100、300、1000、3000、10,000nM這幾個濃度，24孔板每孔加入100μl的標(biāo)準(zhǔn)品。如有必要，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可以根據(jù)類器官中的ATP含量對標(biāo)準(zhǔn)品的濃度范圍進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。如果用類器官培養(yǎng)液來稀釋ATP標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋后需立即進(jìn)行后續(xù)的發(fā)光檢測，否則培養(yǎng)液中的ATPase等可以消耗ATP的酶會導(dǎo)致ATP含量下降。