單細(xì)胞DNA甲基化揭示豬生發(fā)泡卵母細(xì)胞成熟的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制

在哺乳動(dòng)物中，竇卵泡內(nèi)的生發(fā)泡(germinal vesicle，GV) 卵母細(xì)胞可以保持?jǐn)?shù)月或數(shù)年的靜止?fàn)顟B(tài)。促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)激增促進(jìn)了減數(shù)分裂（meiosis）恢復(fù)，使卵母細(xì)胞獲得受精后和早期胚胎發(fā)育能力。同時(shí)還需要卵母細(xì)胞和粒細(xì)胞(granulosa cell，GC)之間高度復(fù)雜的激素和能量互相交流（Bi‑directional communication），以及內(nèi)分泌和旁分泌信號(hào)的分子調(diào)控以促進(jìn)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟。闡明竇卵泡中卵母細(xì)胞獲得能力的分子程序?qū)θ祟?lèi)輔助生殖技術(shù)的成果和提高家畜生育能力具有重要意義，單細(xì)胞組學(xué)技術(shù)為闡明哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞生長(zhǎng)的早期分子機(jī)制提供了新的機(jī)會(huì)。
 
2023年7月22日，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院副教授袁曉龍博士等為第一作者在《Cellular and Molecular Life Sciences》期刊以“Single-cell multi-omics profiling reveals key regulatory mechanisms that poise germinal vesicle oocytes for maturation in pigs”為題發(fā)表研究論文，該研究利用單細(xì)胞DNA甲基化測(cè)序（scBS-seq）和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（SMAART-seq2）等單細(xì)胞多組學(xué)分析技術(shù)揭示了豬生發(fā)泡卵母細(xì)胞成熟的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制，闡明哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞從減數(shù)分裂停止到減數(shù)分裂恢復(fù)的分子機(jī)制。

標(biāo)題：Single-cell multi-omics profiling reveals key regulatory mechanisms that poise germinal vesicle oocytes for maturation in pigs（單細(xì)胞多組學(xué)分析揭示了豬生發(fā)泡卵母細(xì)胞成熟的關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制）
發(fā)表期刊：Cellular and Molecular Life Sciences      
發(fā)表日期：2023年07月22日    
影響因子：IF 8
技術(shù)：單細(xì)胞全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（scWGBS）、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（Smart-seq2）等

研究摘要
本研究以青春期母豬卵巢不同大小竇卵泡中的卵母細(xì)胞為研究對(duì)象，采用單細(xì)胞M&T-seq技術(shù)（scWGBS + Smart -seq2）對(duì)62個(gè)卵母細(xì)胞的細(xì)胞核DNA甲基化組和細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行平行分析。同時(shí)利用10×單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析了竇卵泡內(nèi)細(xì)胞間互相交流機(jī)制。本研究開(kāi)發(fā)了methyConcerto分析包以專(zhuān)門(mén)和全面表征單細(xì)胞甲基化譜和等位基因特異性甲基化。對(duì)豬竇卵泡中單個(gè)卵母細(xì)胞的基因表達(dá)和DNA甲基化進(jìn)行了表征，活性和非活性基因體都顯示出高甲基化水平，從而定義為兩種不同類(lèi)型的卵母細(xì)胞。盡管II型卵母細(xì)胞甲基化水平高于I型，但I(xiàn)I型的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄本數(shù)量是I型的近兩倍。此外，II型卵母細(xì)胞的印跡甲基化模式差異比I型大，II型卵母細(xì)胞的基因表達(dá)和DNA甲基化與MII卵母細(xì)胞更相似。粒細(xì)胞和II型卵母細(xì)胞之間的串?dāng)_活躍，這些觀察結(jié)果表明II型卵母細(xì)胞更容易成熟。最后通過(guò)體外成熟實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了胰島素信號(hào)通路中的胰島素受體底物-1（IRS1）是成熟的關(guān)鍵調(diào)控因子。本研究為哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂停滯和減數(shù)分裂恢復(fù)之間的調(diào)控機(jī)制提供了新的見(jiàn)解，同時(shí)還為未來(lái)的單細(xì)胞甲基化組學(xué)研究提供了新的分析包。
 
材料方法
210日齡的青春期長(zhǎng)白豬(Landrace,L)×大白豬(Yorkshire,Y)二元雜交母豬腹膜內(nèi)注射5 IU孕馬血清促性腺激素（PMSG）以刺激卵泡發(fā)育。48小時(shí)后從母豬身上解剖卵巢，分離出細(xì)胞質(zhì)均勻的裸露卵母細(xì)胞并用1% BSA-PBS洗滌三次。用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)的卵母細(xì)胞在–80°C下儲(chǔ)存，直到進(jìn)一步處理。用于單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的卵母細(xì)胞立即處理收集在8μL細(xì)胞裂解緩沖液中。


研究結(jié)果
（1）細(xì)胞質(zhì)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析（Smart-seq2）揭示母豬竇卵泡中兩種不同的卵母細(xì)胞類(lèi)型
解剖4只青春期母豬的卵巢，并從5個(gè)不同大小的竇卵泡中分離出卵母細(xì)胞，共收集62個(gè)卵母細(xì)胞。根據(jù)其竇卵泡的大小將其分為五組：AF1代表竇形成階段的卵母細(xì)胞（卵泡直徑為0.5-1.8 mm），AF5代表排卵前卵泡（卵泡直徑>7 mm）（圖1A）。對(duì)每個(gè)分離的卵母細(xì)胞進(jìn)行scM&T-seq測(cè)序，利用單細(xì)胞亞硫酸鹽測(cè)序（scWGBS-seq）和Smart-seq2分別對(duì)分離的細(xì)胞核進(jìn)行DNA甲基化和細(xì)胞質(zhì)全長(zhǎng)mRNA平行分析。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，62個(gè)卵母細(xì)胞中的53個(gè)在質(zhì)控后用于下游分析。平均每個(gè)卵母細(xì)胞獲得8.68Gb數(shù)據(jù)。盡管竇卵泡大小不同，但5組卵母細(xì)胞直徑和細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄本數(shù)量（原始reads≥5）相對(duì)相似。主成分分析（PCA）顯示，卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄組不根據(jù)相應(yīng)卵泡大小或遺傳背景進(jìn)行聚類(lèi)（圖1B）。

此外，結(jié)果不受測(cè)序數(shù)據(jù)量和比對(duì)率的影響，即使對(duì)于大小相似的卵泡，細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄組圖譜也呈現(xiàn)高度異質(zhì)性，與此前報(bào)道一致。

不考慮相應(yīng)的卵泡大小，應(yīng)用scran R包中無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)通過(guò)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)一步對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)。清晰的揭示出兩個(gè)主要的卵母細(xì)胞簇：I型卵母細(xì)胞（n=25）和II型卵母細(xì)胞（n=29）（圖1C）。這兩種類(lèi)型的卵母細(xì)胞具有顯著不同的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄本數(shù)量，II型卵母細(xì)胞中平均有10418個(gè)基因，而I型卵母細(xì)胞中平均有5444個(gè)基因。與I型卵母細(xì)胞相比，II型細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄本幾乎是I型的兩倍（圖1D）。此外，每種類(lèi)型的基因方差分布分析表明，II型卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本在單個(gè)卵母細(xì)胞之間表現(xiàn)出更多異質(zhì)性（圖1E）。已知卵母細(xì)胞細(xì)胞類(lèi)型特異性標(biāo)記基因普遍表達(dá)，在新的兩種類(lèi)型之間沒(méi)有差異（圖1F）。此外，與II型卵母細(xì)胞相比，I型卵母細(xì)胞中與細(xì)胞死亡和凋亡相關(guān)的基因表達(dá)水平相似或更低，表明在I型卵母細(xì)胞中觀察到的有限的基因表達(dá)不能歸因于其不健康狀態(tài)。這些觀察結(jié)果確保上述卵母細(xì)胞類(lèi)型不受任何技術(shù)或不必要的生物學(xué)混雜因素驅(qū)動(dòng)。
圖1：竇卵泡期，細(xì)胞質(zhì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（Smart-seq2）將豬卵母細(xì)胞分為兩類(lèi)

1. 從竇形成期（AF1）到排卵前期（AF5），竇卵泡大小不同。
2. 卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄組的PCA分析不根據(jù)相應(yīng)的卵泡大小進(jìn)行聚類(lèi)。
3. t-SNE分析（t-distributed Stochastic Neighbor Embedding）顯示基于圖的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄組無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)，揭示卵母細(xì)胞兩個(gè)明確亞型。
4. 每個(gè)卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄本基因數(shù)量。
5. 基因log表達(dá)在卵母細(xì)胞間的方差分布。
6. 已知的六種卵母細(xì)胞類(lèi)型特異性標(biāo)記基因的表達(dá)水平。

ns不顯著（p>0.05）。E/F采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)
 
（2）兩種不同類(lèi)型卵母細(xì)胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和DNA甲基化
H3K4me3和H3K27me3是哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)的兩個(gè)表觀遺傳標(biāo)記。這兩種類(lèi)型的組蛋白修飾免疫染色顯示，無(wú)論大小，竇卵泡中卵母細(xì)胞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)可能松散或緊密，即非包圍核仁(non-surrounded nucleolus, NSN)或包圍核仁(surrounded nucleolus, SN)。因此在相同大小的卵泡中卵母細(xì)胞的發(fā)育狀態(tài)在染色質(zhì)凝聚方面表現(xiàn)出異質(zhì)性。

scBS-seq分析了50個(gè)卵母細(xì)胞的DNA甲基化狀態(tài)，50個(gè)卵母細(xì)胞中有43個(gè)具有平行的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，包括21個(gè)I型卵母細(xì)胞和22個(gè)II型卵母細(xì)胞。平均每個(gè)卵母細(xì)胞產(chǎn)生44.4 Gb單細(xì)胞全基因組亞硫酸鹽測(cè)序(scWGBS)數(shù)據(jù)(150 bp reads)，平均覆蓋約11.40M(40.7%)CpG位點(diǎn)�？紤]到scBS-seq甲基化狀態(tài)的離散性，與常規(guī)WGBS-seq不同，作者開(kāi)發(fā)了一個(gè)新的methyConcerto分析包，實(shí)現(xiàn)了EBMC（empirical Bayesian methylation caller）來(lái)鑒定甲基化胞嘧啶(mC)位點(diǎn)。由于兩個(gè)樣本對(duì)CG島(CpG island,CGI) 的mC密度平均絕對(duì)誤差(mean absolute error，MAE) 的不同定義，作者對(duì)這43個(gè)卵母細(xì)胞進(jìn)行了無(wú)監(jiān)督分層聚類(lèi)分析。先前的研究揭示了非嚙齒動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物之間的完全成熟卵母細(xì)胞(FGO)甲基化模式截然不同，為進(jìn)一步表征I型和II型卵母細(xì)胞的甲基化模式，首先將本研究中的DNA甲基化和RNA表達(dá)樣本合并創(chuàng)建“偽批量重復(fù)”(pseudo-bulk replicates)樣本，發(fā)現(xiàn)基因體和CGI甲基化水平以及基因表達(dá)與豬FGO高度相關(guān)(相關(guān)系數(shù)≥0.80,p<2.2e−16)。將本研究中活性(TPM≥20)和非活性(TPM< 20)基因體甲基化分布與已發(fā)表的豬FGO和MII及小鼠FGO和MII的RNA-seq和DNA甲基化數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)豬卵母細(xì)胞中活性和非活性基因體的甲基化水平普遍較高，而小鼠卵母細(xì)胞在(偽)批量重復(fù)和單細(xì)胞水平下的非活性基因甲基化水平較低、活性基因甲基化水平較高。這些結(jié)果表明目前數(shù)據(jù)可靠。

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分類(lèi)的兩種類(lèi)型卵母細(xì)胞的DNA甲基化水平在很大程度上不同（圖2A）。因此，作者分析了兩組卵母細(xì)胞在啟動(dòng)子區(qū)、CGI、CpG島上下游2kb以內(nèi)區(qū)域(CpG shore ,CpG島岸)、CpG島岸上下游2kb以內(nèi)區(qū)域(CpG shelve,CpG大陸架)、基因和基因間區(qū)域（圖2B）等不同基因組區(qū)域的mCG水平。分析結(jié)果表明啟動(dòng)子和基因間區(qū)外，其他區(qū)域的II型卵母細(xì)胞平均mCG水平顯著高于I型卵母細(xì)胞（Wilcoxon檢驗(yàn)；p<0.05；圖2B）。此外II型卵母細(xì)胞在CGI區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)域中比I型卵母細(xì)胞表現(xiàn)出顯著更多的高甲基化（>0.75）區(qū)域和顯著更少的低甲基化（<0.25）。在兩種類(lèi)型的卵母細(xì)胞中鑒定出1141個(gè)差異甲基化區(qū)域（differentially methylated regions, DMR），其中99.91%（1140）的DMR在II型卵母細(xì)胞中甲基化水平高于I型。1140個(gè)DMR相關(guān)基因似乎在“細(xì)胞生長(zhǎng)正調(diào)控”、“發(fā)育性細(xì)胞生長(zhǎng)”、PI3K-Akt信號(hào)通路、mToR信號(hào)通路和長(zhǎng)壽調(diào)控通路中顯著富集。編碼和非編碼基因體的泛基因甲基化水平也顯示出典型但不同的模式（圖2C）。根據(jù)這一結(jié)果，II型卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B轉(zhuǎn)錄本數(shù)量顯著高于I型卵母細(xì)胞（圖2D）。II型甲基化密度高于I型，II型卵母細(xì)胞的活性和非活性基因體甲基化水平高于I型，且與MII型更相似（圖2E）。將目前的基因表達(dá)和DNA甲基化數(shù)據(jù)與已發(fā)表的豬MII卵母細(xì)胞的RNA表達(dá)和DNA甲基化數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)II型卵母細(xì)胞與MII卵細(xì)胞更相似。因此，研究將II型卵母細(xì)胞分類(lèi)為染色質(zhì)結(jié)構(gòu)為SN的成熟型卵母細(xì)胞，而將I型卵母細(xì)胞分類(lèi)為染色質(zhì)結(jié)構(gòu)為NSN的未成熟型卵母細(xì)胞。
圖2：豬卵母細(xì)胞DNA甲基化譜。

1. 卵母細(xì)胞甲基化差異熱圖和分層聚類(lèi)。兩組卵母細(xì)胞差異為所有CpG島甲基化水平的平均絕對(duì)誤差(MAE)。
2. 兩組卵母細(xì)胞在不同基因組區(qū)域的mCG密度。頂部顯示兩組卵母細(xì)胞差異p值。
3. TSS上游10Kbp至TES下游10Kbp的平均甲基化水平。兩種類(lèi)型卵母細(xì)胞以及編碼基因和非編碼基因之間差異顯著
4. 編碼DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的三個(gè)基因的Log表達(dá)水平。
5. 16號(hào)染色體基因組視圖舉例說(shuō)明了I/II型卵母細(xì)胞的不同模式。重新分析了已發(fā)表的豬完全成熟卵母細(xì)胞(FGO)和豬MII卵母細(xì)胞的大量數(shù)據(jù)比較。

Ns不顯著(p> 0.05);*p< 0.05，**p< 0.01，***p< 0.001，以此類(lèi)推；B/D采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)
 

（3）II型和I型卵母細(xì)胞的差異性等位基因特異性甲基化
圖3：基因組廣泛分布的ASM CpG揭示了豬卵母細(xì)胞中親本和母本等位基因的普遍不對(duì)稱(chēng)性。

1. scBS-seq的ASM分析流程。
2. 50個(gè)卵母細(xì)胞沿50 Kbp內(nèi)計(jì)算所有卵母細(xì)胞的平均ASM水平（紅點(diǎn)）和平均甲基化水平（藍(lán)點(diǎn)）。兩者之間有明顯的對(duì)應(yīng)關(guān)系。
3. 兩種類(lèi)型卵母細(xì)胞生物學(xué)一致的ASM CpG（BCA-CpGs）數(shù)量和基因組分布。對(duì)角線數(shù)統(tǒng)計(jì)了每種基因組特征中BCA-CpG數(shù)量；非對(duì)角數(shù)統(tǒng)計(jì)了兩種任意類(lèi)型的基因組特征的BCA-CpG交集數(shù)量。
4. BCA-CpG相關(guān)基因的KEGG基因集富集分析（在啟動(dòng)子中至少5個(gè)BCA-CpGs）。部分重要基因通路（青色標(biāo)記）也在差異表達(dá)基因中富集。
5. 大量BCA-CpG僅在II型卵母細(xì)胞中檢測(cè)到。
6. 利用MEME中的SEA分析（Simple Motif Analysis）對(duì)不同類(lèi)型的卵母細(xì)胞的BCA-CpG 52bp序列（CpG和25bp內(nèi)）的motif富集

 

 
（4）比較細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示了卵母細(xì)胞成熟的關(guān)鍵基因通路
圖4：豬卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄組及其與啟動(dòng)子DNA甲基化的協(xié)調(diào)作用。

1. II型卵母細(xì)胞中上調(diào)基因的KEGG富集通路分析。II型卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)表現(xiàn)出繁忙的信號(hào)通路和代謝增強(qiáng)成熟能力。
2. II型卵母細(xì)胞中上調(diào)染色質(zhì)修飾和RNA代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平（歸一化z評(píng)分）。
3. 轉(zhuǎn)化Φ−1 CDF（the inverse of standard normal cumulative function）后的p值分布，檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)基因表達(dá)和啟動(dòng)子甲基化之間的協(xié)調(diào)性。實(shí)際分布偏離了理論正態(tài)分布，并呈負(fù)偏態(tài)，表明部分基因的協(xié)調(diào)性。p＜0.005的基因被視為協(xié)調(diào)基因。
4. C的負(fù)協(xié)調(diào)基因中KEGG基因集富集分析（p<0.05）

 

（5）GC和II型卵母細(xì)胞之間的互相交流
圖5卵泡GC75中的粒細(xì)胞與卵母細(xì)胞互相交流。

1. 竇卵泡GC75體細(xì)胞10×單細(xì)胞基因表達(dá)譜的t-SNE分析。對(duì)三種主要細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行了注釋。
2. 用于注釋細(xì)胞類(lèi)型的六個(gè)典型標(biāo)記的表達(dá)水平。
3. 卵母細(xì)胞scM&T-seq的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄組的PCA分析。卵泡GC75中的卵母細(xì)胞Oocyte75為II型。
4. 8種表皮生長(zhǎng)因子在壁粒細(xì)胞（mGC）、丘粒細(xì)胞（cGC）和卵母細(xì)胞中的表達(dá)水平

 
（6）胰島素信號(hào)通路在卵母細(xì)胞成熟中起關(guān)鍵作用
圖6：體外成熟（IVM）實(shí)驗(yàn)對(duì)六種胰島素信號(hào)通路相關(guān)因子的驗(yàn)證。
A.   CellChat揭示的卵母細(xì)胞間DEG和參與卵母細(xì)胞-粒細(xì)胞互相交流的基因交叉ClueGO網(wǎng)絡(luò)富集。“卵母細(xì)胞減數(shù)分裂”與胰島素信號(hào)通路顯著相關(guān)。
B.   卵母細(xì)胞樣品的顯微照片。有能力的卵母細(xì)胞恢復(fù)分裂，并擠壓出第一極體（first polar body）。
C-D.   微注射45h后6個(gè)基因分別過(guò)表達(dá)（C）或敲低（D）的卵母細(xì)胞IVM成熟率。通過(guò)單Pearson卡方檢驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)與對(duì)照組的比率相等性。ns不顯著，p>0.05；*p<0.05，**p<0.01；n=卵母細(xì)胞重復(fù)。
 

研究結(jié)論
細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄組分析（Smart-seq2）結(jié)果顯示，II型比I型卵母細(xì)胞具有顯著更多的轉(zhuǎn)錄本，但卵母細(xì)胞的全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（scWGBS）分析結(jié)果表明II型卵母細(xì)胞甲基化水平顯著高于I型。II型的印跡模式是漸進(jìn)的，沒(méi)有完全完成，GC和II型卵母細(xì)胞之間的串?dāng)_活躍，表明II型更容易成熟。通過(guò)體外成熟實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了胰島素信號(hào)通路中的IRS1是卵母細(xì)胞成熟的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也為未來(lái)的單細(xì)胞甲基化組學(xué)研究提供了新的方法學(xué)平臺(tái)。


參考文獻(xiàn)：
Yuan X, Chen N, Feng Y, Li N, Pan X, Tian Y, Wang J, Jiang Y, He D, Li J, Gao F. Single-cell multi-omics profiling reveals key regulatory mechanisms that poise germinal vesicle oocytes for maturation in pigs. Cell Mol Life Sci. 2023 Jul 22;80(8):222.