蛋白表達純化實驗流程

利用pFastBac1進行目的蛋白的表達的時候，根據(jù)蛋白純化方式的需要以及融合表達目的蛋白以提高其表達量的需要，可以在質粒構建時添加His標簽或GST標簽。為了防止額外添加的His和GST等蛋白標簽影響目的蛋白的生物學功能和結構研究，可在融合蛋白和標簽之間添加蛋白酶酶切位點，如TEV或PreScission的酶切位點。如果蛋白主要以可溶形式表達，離心收集昆蟲細胞，超聲裂解細胞，但由于昆蟲細胞內蛋白酶種類比較多，需要添加各種蛋白酶抑制劑。離心收集超聲后上清，使用鎳柱或GST柱等純化目的蛋白。同時可以利用離子交換、分子篩層析等進一步純化目的蛋白。純化獲得的蛋白，可以添加適量甘油后保存，或者如果有需要也可以適當濃縮后保存等。
蛋白表達純化詳細步驟：

一、桿狀病毒制備與鑒定
培養(yǎng)昆蟲細胞至密度達到5×10⁶~1×10⁷活細胞/ml，活性≥90%。用培養(yǎng)基將細胞稀釋成2.5×10⁶活細胞/ml 稀釋液，27℃、127 r/min 恢復25 min。用Opti⁃MEM^TMI 無血清培養(yǎng)基稀釋 ExpiFectamine^TMSf 轉染試劑，并加入 Bacmid DNA（pc1⁃mfp5以及gus），室溫孵育5 min，隨后滴加到100 ml細胞稀釋液中。27℃、127 r/min孵育72~96 h至細胞存活率降至 60%~80%，300×g 離心 5 min，保留上清即P0代病毒。
使用 ExpiSf^TMCD 培養(yǎng)基制備連續(xù) 10 倍的病毒稀釋液（10^-2、10^-3、10^-4、10^-5），并在培養(yǎng)基中將細胞稀釋至1.25×10⁶活細胞/ml。將1 ml 病毒稀釋液添加到24深孔板中（每個稀釋液1孔），隨后將1 ml ExpiSf^TMCD培養(yǎng)基添加到無病毒的陰性對照中。將800 μl細胞懸液添加到8個病毒稀釋液以及陰性對照孔中，并在27℃、227 r/min 搖床中避光孵育14~16 h。將24深孔板中細胞分別取出，300×g離心5 min，棄上清。細胞沉淀重懸于100 μl 稀釋的gp64APC抗體中，渦旋 3~5 s，室溫孵育 30 min，PBS洗滌后重懸于1 ml胎牛血清稀釋液中，通過流式細胞儀進行鑒定。

二、蛋白表達與鑒定
培養(yǎng)細胞至細胞密度達到 5×10⁶~1×10⁷活細胞/ml，活性≥90%，用培養(yǎng)基稀釋至最終密度為5×10⁶活細胞/ml，立即加入ExpiSf^TM轉染增強劑，在127 r/min，27℃搖床上孵育18~24 h。當細胞密度恢復至5×10⁶~7×10⁶活細胞/ml，活性≥80%時分別使用病毒感染復數(shù)（multiplicity of infection，MOI，平均每個細胞的病毒感染數(shù)）30、60 以及 120的桿狀病毒感染細胞，27℃、127 r/min培養(yǎng)直至細胞活性降至30%以下，300×g離心5min取上清。取200 μl細胞上清液以及細胞裂解液分別加入50 μl 5×SDS緩沖液，沸水煮6 min，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，在90 V、90 min的狀態(tài)下電轉至醋酸纖維膜上。5% 脫脂奶粉封閉1 h，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳驗證目的蛋白的表達情況”，純化之后還可以通過SDS-PAGE驗證，結合灰度分析驗證蛋白的純度
 
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