酵母表達(dá)服務(wù)技術(shù)流程

酵母表達(dá)是指通過(guò)基因克隆技術(shù)，將外源目的基因構(gòu)建到表達(dá)載體上，并轉(zhuǎn)化至酵母細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，從而獲得大量目的蛋白的方法。通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料，本文匯總了酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中常見(jiàn)的問(wèn)題，分析了可能存在的原因以及解決辦法。
1、問(wèn)：用畢式酵母表達(dá)蛋白，小量表達(dá)并做SDS-PAGE有一條類似三聚體的條帶。大量表達(dá)時(shí)在FPLC上可以看到一個(gè)大峰，但跑電泳卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)條帶？
答：在FPLC上可以看到一個(gè)大峰，但跑電泳卻沒(méi)有發(fā)現(xiàn)條帶，可能的原因有：
（1）上樣時(shí)沒(méi)有目的蛋白，可能是蛋白沒(méi)表達(dá)或親和層析時(shí)沒(méi)洗脫或是穿透了;
（2）目的蛋白結(jié)合在FPLC柱子上沒(méi)被洗脫;
（3）目的蛋白穿透FPLC柱子，你在FPLC上看到的大峰可能是鹽分峰;
（4）電泳時(shí)沒(méi)跑好,目的蛋白沒(méi)被檢測(cè)到.
2、問(wèn)：用G418篩轉(zhuǎn)化有多拷貝的細(xì)胞株,篩了兩次,四個(gè)梯度0.5 mg/ml,1 mg/ml,2 mg/ml,4 mg/ml.結(jié)果都沒(méi)長(zhǎng)出細(xì)胞，空載體對(duì)照也沒(méi)長(zhǎng)出。載體是pPIC9K。用電轉(zhuǎn)涂于MD固體培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化效率較低，每塊板長(zhǎng)出十幾個(gè)點(diǎn)，是否是轉(zhuǎn)化效率低導(dǎo)致的?
答：可以從以下幾點(diǎn)入手：
（1）挑取酵母單菌落，接種至含有5 ml YPD培養(yǎng)基的50 ml三角瓶中，30℃、250~300 r/min培養(yǎng)過(guò)夜;取100-500 μl的培養(yǎng)物接種至含有500 ml新鮮培養(yǎng)基的2L三角搖瓶中，28~30℃、250~300 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，至OD600達(dá)到1.3~1.5。
（2）電擊后馬上加入1ml冰預(yù)冷的1mol的山梨醇溶液將菌體混勻。
（3）推薦：電壓1.5 kV;電容25 μF;電阻200 Ω。電擊時(shí)間為4~10 msec。
3、感受態(tài)制備關(guān)鍵點(diǎn)：
甘油的質(zhì)量，水的質(zhì)量，最好是超純的，如果要求完美，洗瓶不要有洗滌劑殘留，先將瓶裝滿超純水高壓，再棄去，再配置10%甘油。收菌以半對(duì)數(shù)期合適，一般OD0.5收菌，過(guò)則不佳，直接取-80℃菌種搖，次日轉(zhuǎn)種，從盤上菌落搖的要差，33-34℃搖菌結(jié)果更理想。
在以冰冷10%甘油等量，半量，1/4量洗滌時(shí)一定低溫，重懸時(shí)應(yīng)輕震蕩，棄洗滌液應(yīng)倒干靜，那怕?lián)p掉部分細(xì)菌。最后大概500 ml能做3-4 ml感受態(tài)，液氮中凍10 min轉(zhuǎn)-80℃冰箱，也可不冷凍，直接用來(lái)轉(zhuǎn)化。
感受態(tài)應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)濃度質(zhì)粒電轉(zhuǎn)記算效率，一般大于10 ⁹/mg，操做以1 ng/ul質(zhì)粒1 ul加40 ul感受態(tài)置0.1杯，電轉(zhuǎn)后以最快的速度加入1 ml soc復(fù)活，100-150轉(zhuǎn)搖1h，取1/1000鋪盤應(yīng)大于1000個(gè)菌生長(zhǎng)。這樣用于建庫(kù)工作才行。
電轉(zhuǎn)時(shí)質(zhì)�；蜻B接物盡可能少，以減少離子，實(shí)際上離子高，電流直接通過(guò)，沒(méi)有場(chǎng)強(qiáng)，質(zhì)粒是進(jìn)不去的。
總結(jié)：
（1）任和有關(guān)東西都要干凈，保證沒(méi)有離子。
（2）從接觸甘油開(kāi)始就保持恒0℃。
（3）電擊后復(fù)活要快。
4、問(wèn)：轉(zhuǎn)化了一個(gè)基因到畢赤酵母，蛋白有表達(dá)，但pcr無(wú)論如何也檢測(cè)不到陽(yáng)性的特性條帶，該如何改進(jìn)？
答：提取酵母DNA當(dāng)模板時(shí)，不能按操作手冊(cè)說(shuō)明的模板的用量進(jìn)行PCR，而應(yīng)該降低模板的用量，一般在ng水平已足夠。譬如，挑取單菌落于3 mL適宜培養(yǎng)液中，搖菌過(guò)夜，用試劑盒提取酵母DNA，取1uL提取產(chǎn)物作為模板進(jìn)行PCR鑒定已足夠。
參考步驟
（1）直接用槍尖或者牙簽取單克隆到10 ul無(wú)菌去離子水中;
（2）加5 ul 5 u /ul的溶細(xì)胞酶(SIGMA);
（3）37℃孵育30分鐘;
（4）-70℃15分鐘;
（5）煮沸5分鐘;
（6）12000 rmp離心5分鐘;
（7）取上清5 ul到50 ul PCR反應(yīng)體系。
5、問(wèn)：表達(dá)3KD左右的抗菌肽，電泳沒(méi)有目的蛋白，表達(dá)小肽有哪些注意的方面?
答：首先確定蛋白是不是沒(méi)有分泌，看看菌體蛋白中有沒(méi)有，如果沒(méi)有的話：
第一、構(gòu)建多種分泌表達(dá)載體，看看各種表達(dá)載體因素如載體整合方式，整合拷貝數(shù)，5'非翻譯區(qū)及甲醇利用表型對(duì)表達(dá)量的影響。
第二、一般來(lái)說(shuō)發(fā)酵灌較搖瓶培養(yǎng)表達(dá)量更高（10-20倍）。
第三、選用酵母偏愛(ài)密碼子。
第四、選用蛋白酶缺陷型得宿主菌如SMD1168等。
6、問(wèn)：用畢赤酵母表達(dá)蛋白（非表達(dá)分泌型），經(jīng)常會(huì)遇到表達(dá)量挺高的，但破完細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)目的蛋白都在沉淀中沒(méi)法往下純化，請(qǐng)問(wèn)這是為什么?
答：表達(dá)量高的話,表達(dá)的蛋白很容易出現(xiàn)不正確的折疊而形成不溶性的產(chǎn)物，因此要提高可溶性蛋白的表達(dá)量，最好不要讓目的基因過(guò)量表達(dá)�？刹扇∫恍┲T如降低溫度等的措施。