RNA-BS揭示葉酸調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞m5C修飾和mRNA翻譯機(jī)制

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葉酸作為一種必需B族維生素，是一種具有重要生物學(xué)功能（包括DNA甲基化調(diào)控）的甲基供體。正常的神經(jīng)發(fā)育和生理對(duì)細(xì)胞葉酸水平很敏感，而葉酸缺乏或過(guò)量都可能導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病。最近已有研究表明葉酸與哺乳動(dòng)物線粒體中tRNA m5C修飾和翻譯有關(guān)。然而，葉酸攝入對(duì)神經(jīng)元mRNA m5C修飾和翻譯的影響在很大程度上仍然未知。
 
2022年11月23日，美國(guó)弗吉尼亞理工大學(xué)謝荷煌教授團(tuán)隊(duì)以“Folate regulates RNA m5C modification and translation in neural stem cells”為題在《BMC Biology》雜志上發(fā)表研究論文，該研究通過(guò)RNA-BS和對(duì)應(yīng)的RNA-seq測(cè)序分析揭示了葉酸對(duì)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell，NSC）轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)mRNA m5C甲基化和翻譯的作用，并闡明了mRNA m5C甲基化和mRNA翻譯之間的潛在聯(lián)系。
標(biāo)題：Folate regulates RNA m5C modification and translation in neural stem cells（葉酸調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的RNA m5C修飾和翻譯）
時(shí)間：2022.11.23
期刊：BMC Biology
影響因子：IF 5.4
技術(shù)平臺(tái)：RNA-BS、RNA-seq、RT-qPCR、Western blot等
樣本：
從側(cè)腦室室管膜下區(qū)(SVZ)分離小鼠神經(jīng)干細(xì)胞（NSC），將NSC放置在聚鳥(niǎo)氨酸和層粘連蛋白包被的培養(yǎng)皿中，并在第2天更換培養(yǎng)基將細(xì)胞培育4天。根據(jù)葉酸（FA）濃度將細(xì)胞分為三個(gè)處理組：低FA組（LF，1.5μmol/L）、中FA組（MF，10μmol/L）和高FA組（HF，80μmol/L），兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共6個(gè)mRNA-seq文庫(kù)和6個(gè)mRNA BS-seq文庫(kù)。


實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖


研究摘要：
本研究在三種不同濃度的葉酸中培養(yǎng)的NSC顯示出不同的mRNA甲基化譜。盡管只發(fā)現(xiàn)了少數(shù)差異表達(dá)基因，但在葉酸缺乏或補(bǔ)充的神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）中發(fā)現(xiàn)數(shù)百個(gè)差異翻譯基因。低濃度葉酸誘導(dǎo)的差異翻譯基因與細(xì)胞質(zhì)翻譯和線粒體功能相關(guān)，而高濃度葉酸誘導(dǎo)的差異翻譯基因與神經(jīng)干細(xì)胞增殖增加相關(guān)。與總mRNA相比，多聚體mRNA中m5C水平高。此外，綜合分析表明RNA m5C甲基化與mRNA翻譯效率之間存在轉(zhuǎn)錄特異性關(guān)系。
 
研究結(jié)果
（1）不同葉酸濃度對(duì)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞中mRNA豐度的影響

小鼠NSC培養(yǎng)物用神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)記物Nestin(細(xì)胞質(zhì)，綠色)和Sox2(細(xì)胞核，紅色)染色，并用DAPI(細(xì)胞核，藍(lán)色)復(fù)染

圖1：葉酸對(duì)NSC中mRNA豐度的影響。火山圖顯示LF與MF（左）和HF與MF（右)
 
 
（2）小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的整體m5C mRNA圖譜
圖2：mRNA BS-seq數(shù)據(jù)集中高置信度m5C位點(diǎn)表征。

1. 兩個(gè)重復(fù)之間m5C位點(diǎn)重疊維恩圖。
2. 兩個(gè)重復(fù)之間重疊m5C位點(diǎn)的甲基化水平相關(guān)性點(diǎn)圖。
3. 兩個(gè)重復(fù)中重疊和非重疊m5C位點(diǎn)甲基化水平箱線圖。

圖3：m5C修飾在小鼠神經(jīng)干細(xì)胞總mRNA中的分布。
a-b.  NSC中m5C位點(diǎn)(a)和m5C修飾(b)的mRNA占總mRNA的數(shù)量條形圖。
c.    NSC中總mRNA中m5C位點(diǎn)的甲基化水平箱線圖。
d.    NSC中總mRNA中m5C位點(diǎn)附近序列標(biāo)記。
e.    m5C位點(diǎn)沿mRNA轉(zhuǎn)錄本(5'UTR、CDS、3'UTR)分布密度圖。顯示mRNA m5C位點(diǎn)百分比的移動(dòng)平均值。
f.     三種不同濃度葉酸條件下(LF、MF、HF) m5C位點(diǎn)重疊維恩圖。
g.    m5C修飾的mRNA在LF、MF和HF中的GO分析氣泡圖


（3）葉酸以劑量依賴性方式誘導(dǎo)mRNA翻譯變化
圖4：葉酸缺乏和補(bǔ)充影響NSC的mRNA翻譯。
a-b.  分離無(wú)核糖體和結(jié)合核糖體RNA的蔗糖梯度示意圖(a)和254nm下記錄的代表性polysome圖譜(1.5μM FA，replicate 1)的部分polysome (9-15部分)(b)。
c.    LF和MF之間的差異翻譯基因(DTGs)的比較火山圖。
d.    HF和MF之間差異翻譯基因(DTGs)的比較火山圖。
e.    DTGs的GO分析氣泡圖，LF的翻譯效率降低(LF vs MF下調(diào))，HF的翻譯效率降低(HF vs MF下調(diào))，HF的翻譯效率增加(HF vs MF上調(diào))

（4）葉酸誘導(dǎo)polysome mRNA m5C甲基化水平變化
圖5：葉酸對(duì)小鼠NSC polysome mRNA m5C甲基化的影響。

1. Polysome mRNA中m5C位點(diǎn)附近序列的序列頻率標(biāo)志。
2. m5C位點(diǎn)沿mRNA轉(zhuǎn)錄本（5′UTR、CDS、3′UTR）分布密度圖。顯示百分比的移動(dòng)平均值。
3. Polysome mRNA中m5C位點(diǎn)甲基化水平方框圖。
4. pMF和pLF之間差異甲基化m5C位點(diǎn)的甲基化水平比較熱圖。兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)（R1、R2）。
5. pMF和pHF之間差異甲基化m5C位點(diǎn)的甲基化水平的比較熱圖。兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)（R1、R2）。
6. pMF vs pLF和pMF vs pHF mRNA DMS修飾的GO注釋。

（5）m5C修飾與mRNA翻譯相關(guān)性

圖6：m5C甲基化與mRNA翻譯相關(guān)性。
a–c.   總mRNA和Polysome mRNA之間的差異甲基化的m5C位點(diǎn)甲基化譜熱圖。
d–f.   總mRNA和Polysome mRNA之間的差異表達(dá)基因（DEG）Volcano圖。
g–i.   m5C甲基化水平顯著變化的mRNA分布，分三類：m5C甲基化與mRNA翻譯效率之間的正相關(guān)、負(fù)相關(guān)和中性相關(guān)。
j.     不同m5C甲基化mRNA翻譯相關(guān)類別位點(diǎn)分布的堆積條形圖。
k.    三種不同葉酸濃度條件下m5C甲基化和mRNA翻譯之間具有一致正/負(fù)/中性相關(guān)性的轉(zhuǎn)錄本匯總表。


研究結(jié)論
本研究通過(guò)RNA-BS和RNA-seq聯(lián)合分析表明了葉酸對(duì)NSC轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)mRNA m5C甲基化和翻譯的作用，并揭示了mRNA m5C甲基化和mRNA翻譯之間的潛在聯(lián)系。m5C甲基化調(diào)控mRNA翻譯的機(jī)制值得使用體內(nèi)模型進(jìn)行進(jìn)一步研究。


參考文獻(xiàn)：
Xu X, Johnson Z, Wang A, Padget RL, Smyth JW, Xie H. Folate regulates RNA m5C modification and translation in neural stem cells. BMC Biol. 2022 Nov 23;20(1):261.