端粒酶活性檢測試劑盒使用說明（雙色熒光QPCR 探針法）
【產(chǎn)品規(guī)格】
BPT5 0 50T (50人份 ，其 中4個組分按5個10人份獨立包裝 ，Biowing® Specific Reverse Transcription Primer按20ul*2獨立包裝 。)
【產(chǎn)品說明】
端粒酶(Telomerase ) 是一種酶促核糖核蛋 白復合物 。其催化亞基 (TERT) 具有逆轉(zhuǎn)錄酶的特性，TERT被認為是端粒酶活性表達的關(guān)鍵組分，其編碼的mRNA水平與端粒酶活性一致，與端粒酶的活化程度密切相關(guān)。 因此，對端粒酶催化亞基的檢測可以間接反映樣本中端粒酶活性。
本產(chǎn)品試劑盒采用雙色熒光qPCR (TaqMan探針法) 檢測端粒酶催化亞基TERT基 因和 內(nèi)參基 因
GAPDH 。通過提取細胞RNA ，利用特異性逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)， 以cDNA為模板在單管中利用多重熒光定量PCR進行擴增反應(yīng) (雙重探針： FAM 、Cy5) 。選用293T細胞為陽性對照以及MRC- 5細胞為陰性對照，判斷樣本中是否有TERT基因表達 。該試劑盒具有以下特點：
1 . 靈敏：雙色探針，靈敏度高。
2 . 穩(wěn)定：全程閉管操作，無交叉污染。
3 . 可靠：含內(nèi)參基因，避免假陰性。
4 . 方便：操作簡單，無需電泳步驟。
5. 定量： 以CT值判斷，可定量檢測。
【運輸及保存條件】
低溫冷凍運輸 ，避光-20℃保存 ，有效期6個月。開蓋后，4℃保存，有效期1周。
【操作步驟】
【操作步驟】
1. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
使用Trizol法抽提細胞RNA ，RNA純度A260/280在1 .9 -2 . 0之間 。取1ug RNA使用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑 盒 ( 貨 號 ： K1622或K16225 ) ，將試劑盒中的 Random Primer 替換成 Biowing® Specific Reverse Transcription Primers進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA。
2. qPCR反應(yīng)體系及條件
2. 1 陽性對照處理
將陽性對照cDNA進行4倍、8倍的梯度稀釋，每個梯度建議三重復。
2.2 陰性對照處理
將陰性對照cDNA進行4倍、8倍的梯度稀釋，每個梯度建議三重復。
2.3 樣本處理
將待測樣本cDNA進行4倍稀釋作為測試濃度，每個樣本做三重復。
【基線設(shè)置】
(以ABI 7500為例)一般默認起始和終止基線位置為3 - 15個循環(huán)，應(yīng)根據(jù)內(nèi)參基因和TERT基因?qū)嶋H擴增曲線手動將基線起始循環(huán)數(shù)調(diào)整為指數(shù)增長期之前即可。
【閾值設(shè)置】
(以ABI 7500為例)內(nèi)參閾值設(shè)定： 以陽性對照4倍稀釋cDNA定內(nèi)參基因擴增曲線閾值， 內(nèi)參基因(Cy5)初始濃度的CT值定為17±3；
TERT閾值設(shè)定： 以陽性對照4倍稀釋cDNA定TERT基因擴增曲線閾值，TERT基因(FAM)初始濃度CT值的定為25±3。
【結(jié)果判讀】
【結(jié)果判讀】
1. 陽性對照4倍稀釋后TERT基因Ct值在25±3 ， 內(nèi)參基因Ct值在17±3 ，8倍稀釋后TERT基因Ct值在26±3，內(nèi)參基因Ct值在18±3 。TERT基因和內(nèi)參基因之間∆CT維持在9±3，保持穩(wěn)定。
2 . 陰性對照經(jīng)4倍、8倍梯度稀釋后，TERT基因Ct值≥35 (或檢測不到) ， 內(nèi)參基因Ct值仍在18±3之間，判定為端粒酶活性為陰性。
3. 結(jié)果說明
若待測樣本內(nèi)參基因Ct值在17±3之間，TERT基因Ct值＜35且擴增曲線正常，則樣本端粒酶活性
為陽性。
若待測樣本內(nèi)參基因Ct值在17±3之間，TERT基因Ct值≥35且無明顯的擴增曲線則樣本無端粒酶
活性。
【說明】
【說明】
1 . 待測樣本cDNA 4倍稀釋作為模板，三次技術(shù)重復，不設(shè)置梯度稀釋； 陽性對照、 陰性對照進行4倍、8倍梯度稀釋，建議分別做三重復；避免偶然誤差的產(chǎn)生。
2. 如果陽性/陰性對照4倍稀釋后內(nèi)參基因Ct值＞20 ，表明參考品有降解或者試劑盒擴增效率下降。
3. 如果所有樣本4倍稀釋后內(nèi)參基因Ct值＞20 ，表明試劑盒的擴增效率下降。
4. 如果陽性對照4倍稀釋后TERT基因Ct值＞28 ，表明TERT基因檢測系統(tǒng)失效。
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