ChIP-seq等在揭示Runx2通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)激活肝星狀細(xì)胞中的應(yīng)用
肌成纖維細(xì)胞（myofibroblasts）主要由肝臟中活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells HSC)組成，在肝纖維化進(jìn)展中發(fā)揮著核心作用。由于肌成纖維細(xì)胞主要負(fù)責(zé)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成、沉積和重塑，因此靶向HSC被認(rèn)為是肝纖維化治療的一種新策略，并且正在進(jìn)行越來越多的臨床前研究和臨床試驗(yàn)。先前的研究表明，runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 (Runx2)與非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但其在肝星狀細(xì)胞活化和肝纖維化中的具體作用尚不清楚。
2023年7月5日，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院鄧亮博士團(tuán)隊(duì)在《Clin Transl Med》雜志發(fā)表題為“Runx2 activates hepatic stellate cells to promote liver fibrosis via transcriptionally regulating Itgav expression”的研究論文，該研究以人和小鼠的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells HSC)為研究對(duì)象，通過RNA-seq和ChIP-seq等分析揭示Runx2在肝纖維化過程中通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控Itgav（(integrin alpha-V)表達(dá)對(duì)HSC活化至關(guān)重要，提示Runx2可能是肝纖維化的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。
標(biāo)題：Runx2 activates hepatic stellate cells to promote liver fibrosis via transcriptionally regulating Itgav expression（Runx2通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控Itgav表達(dá)活化肝星狀細(xì)胞以促進(jìn)肝纖維化）
時(shí)間：2023-07-05
期刊：Clinical and Translational Medicine
影響因子：IF 10.6
技術(shù)平臺(tái)：ChIP-seq、RNA-seq、Western blot、qRT-PCR等
研究摘要：
本研究分析結(jié)果表明，Runx2表達(dá)在不同病因的人肝纖維化中顯著上調(diào)；在小鼠肝纖維化過程中，Runx2表達(dá)也逐漸上調(diào)，且Runx2主要在活化的HSC中表達(dá)。HSC中Runx2敲除可以顯著減少由CCl4誘導(dǎo)、由1,4-二氫-2, 3,5-吡啶二甲酸二乙酯（3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine）（DDC）誘導(dǎo)、由蛋氨酸膽堿缺乏癥（MCD）誘導(dǎo)的肝纖維化，而肝通過注射HBAAV-Runx2或VA-Lip-Runx2的Runx2過表達(dá)加劇了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。體外實(shí)驗(yàn)分析表明，Runx2促進(jìn)HSC的活化和增殖，而在HSC中Runx2的敲除則抑制了這些作用。RNA-seq和Runx2的ChIP-seq分析表明，Runx2可以通過與其啟動(dòng)子結(jié)合以促進(jìn)整合素α - v (integrin alpha-V，Itgav)表達(dá)。阻斷Itgav表達(dá)可減少Runx2誘導(dǎo)的HSC活化和肝纖維化。此外研究還揭示了細(xì)胞因子（TGF-β1、PDGF、EGF）通過蛋白激酶A（PKA）促進(jìn)HSC中Runx2表達(dá)和核轉(zhuǎn)位(nuclear translocation)。
Runx2促進(jìn)HSC活化和肝纖維化過程的示意圖
研究結(jié)果
（1）Runx2表達(dá)在肝纖維化過程中逐漸上調(diào)
圖1：Runx2表達(dá)在肝纖維化發(fā)展過程中逐漸上調(diào)。
（A） 與對(duì)照樣本相比，Runx2在GSE25097隊(duì)列的人肝硬化組織（左）、GSE103580隊(duì)列的酒精性肝炎或肝硬化的人肝臟組織（中）以及GSE49541隊(duì)列的不同纖維化階段（FS）的人肝纖維化組織（右）中的mRNA表達(dá)。
（B-C） Western blot分析和qRT-PCR檢測(cè)人非纖維化或肝硬化肝樣品中Runx2的蛋白和mRNA水平（n=3）。
（D） 從非纖維化或肝硬化患者采集人肝臟組織樣本。對(duì)各組肝臟組織中代表性的Masson組織學(xué)、α-SMA和Runx2的IHC染色分析。ImageJ軟件定量檢測(cè)陽性染色區(qū)域。比例尺：50μm（n=10）。
（E） 與對(duì)照樣品相比，Runx2在GSE31431小鼠肝纖維化組織中的mRNA表達(dá)。
（F-G）腹腔注射CCl4（5μL/G體重）誘導(dǎo)小鼠肝纖維化4周。Western blot和qRT-PCR分析肝臟組織Runx2的蛋白和mRNA水平（n=3）。
（H） 小鼠被喂食高脂肪飲食12個(gè)月以誘導(dǎo)NASH相關(guān)纖維化。IP注射CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化4周。對(duì)各組肝臟組織中代表性Masson組織學(xué)、α-SMA和Runx2的IHC染色。ImageJ軟件定量測(cè)量陽性染色區(qū)域。比例尺：50μm（n=6）。數(shù)據(jù)為平均值±SEM，*p、**p<0.05與對(duì)照組比較#p＜0.01；ns，不顯著。
（2）Runx2特異性位于體內(nèi)活化的HSC中，并在體外HSC活化過程中以時(shí)間依賴性方式增加
（B） 以olive或CCl4處理小鼠4周后，分離出原代HSC，然后RNA-seq分析檢測(cè)沉默HSC（qHSC，olive）和活化HSC（aHSC，CCl4），并進(jìn)行火山圖分析。
（C） 小提琴圖顯示了每個(gè)聚類所選標(biāo)記基因（Runx2、α-SMA和Col1a1）的相對(duì)表達(dá)；平均每個(gè)條件1000個(gè)細(xì)胞。
（D-E）從正常小鼠肝臟中分離原代HSC，并在指定時(shí)間間隔（第1、4和7天）培養(yǎng)。Western blot和qRT-PCR檢測(cè)Runx2、α-SMA、I型膠原（collagen I）和TGF-β1的蛋白和mRNA表達(dá)（n=5）。
（F） Runx2和α-SMA在指定時(shí)間間隔培養(yǎng)的原代HSC中的免疫熒光染色。顯示高倍圖像（n=3）。數(shù)據(jù)為平均值±SEM，與對(duì)照組相比*p＜0.05。
（3）HSC特異性敲除Runx2可以減少CCl4誘導(dǎo)、DDC誘導(dǎo)或MCD誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化
（B-C）用olive或CCl4處理HSC小鼠4周，利用Western blot和qRT-PCR分析Runx2、I型膠原和α-SMA在Runx2f+ 和Runx2△+HSC中的蛋白質(zhì)和mRNA水平（n＝3）。
（D） 用olive或CCl4處理的Runx2f+和Runx2小鼠肝臟組織中I型膠原和a-SMA的Masson和IHC染色的代表性顯微圖。比例尺：100μm（n=5）。
（E） Runx2f+和Runx2△+HSC小鼠用0.1%的DDC喂養(yǎng)4周以誘導(dǎo)膽汁淤滯，或用MCD喂養(yǎng)8周以誘導(dǎo)NASH。顯示了a-SMA的H&E、Masson和IHC染色的代表性顯微圖。比例尺：100μm（n=3）。
（4）Runx2過表達(dá)加劇了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化
圖4：Runx2過表達(dá)加劇了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化
（A） Runx2在肝纖維化中過表達(dá)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。小鼠在通過HBAAV-ctrl或HBAAV-Runx2（100μL/只，1×1012 V g/mL，門靜脈）注射3周后，連續(xù)4周注射olive或CCl4。
（B-C）Western blot和qRT-PCR檢測(cè)Runx2、I型膠原和α-SMA的蛋白和mRNA表達(dá)（n=3）。
（D） 經(jīng)olive或CCl4處理的HBAAV-ctrl或HBAAV-Runx2小鼠中膠原I和a-SMA的Masson和IHC染色的代表性圖像。比例尺：100μm（n=5）。
（5）Runx2在體外調(diào)控HSC活化
（B） 從Runx2△/△HSC或HBAAV-Runx2小鼠中分離出原代HSC，并在3%FBS條件下培養(yǎng)4天。
（C） 從Runx2f/f 或 Runx2△/△HSC小鼠中分離的原代HSC，通過qRT-PCR測(cè)定纖維相關(guān)基因。
（D） Runx2、α-SMA、I型膠原和TGF-β1在Runx2f/f或Runx2△/△HSC小鼠中分離的原代HSC中的Western blot分析。
（E-F）通過qRT-PCR和Western blot分析從HBAAV-ctrl或HBAAV-Runx2小鼠中分離的原代HSC中Runx2、α-SMA、I型膠原和TGF-β1的mRNA和蛋白表達(dá)。
（G-H）通過流式細(xì)胞術(shù)分析原代HSC中各個(gè)細(xì)胞周期階段的指數(shù)生長百分比。
（I） 從Runx2f/f或Runx2△/△HSC小鼠中分離的原代HSC，通過免疫熒光染色檢測(cè)α-SMA活化特征（n＝3）。
（6）Itgav是Runx2在肝纖維化中的直接下游靶點(diǎn)
圖6：Itgav(integrin alpha-V)是Runx2在肝纖維化中的直接下游靶點(diǎn)
（A） 對(duì)用Runx2或Scramble siRNA轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)3天的原代HSC進(jìn)行RNA-seq分析，并對(duì)差異表達(dá)基因（DEG）進(jìn)行KEGG通路富集分析。
（B） 對(duì)從HBAAV-Runx2小鼠分離的原代HSC進(jìn)行Runx2 ChIP-seq分析，并對(duì)DEG進(jìn)行KEGG通路富集分析。
（C） 通過ChIP-seq分析，對(duì)348個(gè)啟動(dòng)子與Runx2結(jié)合基因和183個(gè)TGF-β通路相關(guān)基因進(jìn)行交叉分析。
（D） 基因組圖譜顯示Itgav轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)的Runx2結(jié)合位點(diǎn)（Chr2:8372357-83723806）。
（E） 經(jīng)pCDNA 3.1-ctrl或pCDNA 3.1-Runx2轉(zhuǎn)染的小鼠HSC細(xì)胞系上進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因分析。
（F-G） 經(jīng)CCl4處理4周的Runx2f/+、Runx2△/+HSC、HBAAV-ctrl和HBAAV-Runx2小鼠中采集肝臟組織。通過qRT-PCR和Western blot分析Itgav的mRNA和蛋白表達(dá)。
（H-I） 分別從Runx2f/f小鼠、Runx2△/△HSC小鼠、HBAAV-ctrl小鼠和HBAAV-Runx2小鼠中分離出原代HSC。用qRT-PCR分析Itgav的mRNA表達(dá)。Western blot分析Itgav及其下游激酶（FAK、pFAK、PI3K、pPI3K，Smad2/3和pSmad2/3）的蛋白表達(dá)。數(shù)據(jù)為平均值±SEM；n＝3， *p＜0.05，#p＜0.05。
（7）αv整合素抑制劑阻斷Runx2過表達(dá)引起的CCl4誘導(dǎo)肝纖維化加劇
（B-C）Western blot和qRT-PCR分析原發(fā)性HSC中α-SMA的蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)水平（n=3）。
（D） CWHM-12體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的靶向處理方案。小鼠服用CCl4 2周，然后插入含有CWHM-12（100mg/kg/天）或安慰劑（載體）的Alzet微型泵，隨后再服用2周CCl4。
（E-F）qRT-PCR和Westernblot分析檢測(cè)用或不用CWHM-12處理的HBAAV-Runx2或HBAAV-ctrl小鼠的肝臟組織中α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)（n=3）。
（G） I型膠原和α-SMA的Masson和IHC染色的代表性顯微圖。比例尺：100μm（n=5）
（8）PKA調(diào)控HSC中Runx2的活化和核轉(zhuǎn)位（nuclear translocation）
（B） 經(jīng)或不經(jīng)TGF-β1，然后用PKA活化劑（8-Bromo-cAMP，0.5 nM/mL）或抑制劑（n=3）處理的原代HSC中細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)Runx2的Western blot分析。
（C） PKA抑制劑或活化劑處理的原代HSC中Runx2和α-SMA的免疫熒光染色（n=3）。
參考文獻(xiàn)：
Zhong L, Zhao J, Huang L, Liu Y, Pang X, Zhan K, Li S, Xue Q, Pan X, Deng L. Runx2 activates hepatic stellate cells to promote liver fibrosis via transcriptionally regulating Itgav expression. Clin Transl Med. 2023 Jul;13(7):e1316.
2023年7月5日，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院鄧亮博士團(tuán)隊(duì)在《Clin Transl Med》雜志發(fā)表題為“Runx2 activates hepatic stellate cells to promote liver fibrosis via transcriptionally regulating Itgav expression”的研究論文，該研究以人和小鼠的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells HSC)為研究對(duì)象，通過RNA-seq和ChIP-seq等分析揭示Runx2在肝纖維化過程中通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控Itgav（(integrin alpha-V)表達(dá)對(duì)HSC活化至關(guān)重要，提示Runx2可能是肝纖維化的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。
標(biāo)題：Runx2 activates hepatic stellate cells to promote liver fibrosis via transcriptionally regulating Itgav expression（Runx2通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控Itgav表達(dá)活化肝星狀細(xì)胞以促進(jìn)肝纖維化）
時(shí)間：2023-07-05
期刊：Clinical and Translational Medicine
影響因子：IF 10.6
技術(shù)平臺(tái)：ChIP-seq、RNA-seq、Western blot、qRT-PCR等
研究摘要：
本研究分析結(jié)果表明，Runx2表達(dá)在不同病因的人肝纖維化中顯著上調(diào)；在小鼠肝纖維化過程中，Runx2表達(dá)也逐漸上調(diào)，且Runx2主要在活化的HSC中表達(dá)。HSC中Runx2敲除可以顯著減少由CCl4誘導(dǎo)、由1,4-二氫-2, 3,5-吡啶二甲酸二乙酯（3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine）（DDC）誘導(dǎo)、由蛋氨酸膽堿缺乏癥（MCD）誘導(dǎo)的肝纖維化，而肝通過注射HBAAV-Runx2或VA-Lip-Runx2的Runx2過表達(dá)加劇了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。體外實(shí)驗(yàn)分析表明，Runx2促進(jìn)HSC的活化和增殖，而在HSC中Runx2的敲除則抑制了這些作用。RNA-seq和Runx2的ChIP-seq分析表明，Runx2可以通過與其啟動(dòng)子結(jié)合以促進(jìn)整合素α - v (integrin alpha-V，Itgav)表達(dá)。阻斷Itgav表達(dá)可減少Runx2誘導(dǎo)的HSC活化和肝纖維化。此外研究還揭示了細(xì)胞因子（TGF-β1、PDGF、EGF）通過蛋白激酶A（PKA）促進(jìn)HSC中Runx2表達(dá)和核轉(zhuǎn)位(nuclear translocation)。
Runx2促進(jìn)HSC活化和肝纖維化過程的示意圖
研究結(jié)果
（1）Runx2表達(dá)在肝纖維化過程中逐漸上調(diào)
圖1：Runx2表達(dá)在肝纖維化發(fā)展過程中逐漸上調(diào)。
（B-C） Western blot分析和qRT-PCR檢測(cè)人非纖維化或肝硬化肝樣品中Runx2的蛋白和mRNA水平（n=3）。
（D） 從非纖維化或肝硬化患者采集人肝臟組織樣本。對(duì)各組肝臟組織中代表性的Masson組織學(xué)、α-SMA和Runx2的IHC染色分析。ImageJ軟件定量檢測(cè)陽性染色區(qū)域。比例尺：50μm（n=10）。
（E） 與對(duì)照樣品相比，Runx2在GSE31431小鼠肝纖維化組織中的mRNA表達(dá)。
（F-G）腹腔注射CCl4（5μL/G體重）誘導(dǎo)小鼠肝纖維化4周。Western blot和qRT-PCR分析肝臟組織Runx2的蛋白和mRNA水平（n=3）。
（H） 小鼠被喂食高脂肪飲食12個(gè)月以誘導(dǎo)NASH相關(guān)纖維化。IP注射CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化4周。對(duì)各組肝臟組織中代表性Masson組織學(xué)、α-SMA和Runx2的IHC染色。ImageJ軟件定量測(cè)量陽性染色區(qū)域。比例尺：50μm（n=6）。數(shù)據(jù)為平均值±SEM，*p、**p<0.05與對(duì)照組比較#p＜0.01；ns，不顯著。
（2）Runx2特異性位于體內(nèi)活化的HSC中，并在體外HSC活化過程中以時(shí)間依賴性方式增加
圖2：Runx2在體內(nèi)特異性位于活化的HSC中，并在體外HSC活化過程中以時(shí)間依賴性方式增加。
（A） CCl4處理的小鼠和肝硬化患者肝切片的免疫熒光顯微圖，活化HSC（α-SMA，紅色）、內(nèi)皮細(xì)胞（CD31，紅色）和Kupffer細(xì)胞（F4/80，紅色）染色，Runx2為綠色。比例尺：小鼠20μm；50μm（n=3）。（B） 以olive或CCl4處理小鼠4周后，分離出原代HSC，然后RNA-seq分析檢測(cè)沉默HSC（qHSC，olive）和活化HSC（aHSC，CCl4），并進(jìn)行火山圖分析。
（C） 小提琴圖顯示了每個(gè)聚類所選標(biāo)記基因（Runx2、α-SMA和Col1a1）的相對(duì)表達(dá)；平均每個(gè)條件1000個(gè)細(xì)胞。
（D-E）從正常小鼠肝臟中分離原代HSC，并在指定時(shí)間間隔（第1、4和7天）培養(yǎng)。Western blot和qRT-PCR檢測(cè)Runx2、α-SMA、I型膠原（collagen I）和TGF-β1的蛋白和mRNA表達(dá)（n=5）。
（F） Runx2和α-SMA在指定時(shí)間間隔培養(yǎng)的原代HSC中的免疫熒光染色。顯示高倍圖像（n=3）。數(shù)據(jù)為平均值±SEM，與對(duì)照組相比*p＜0.05。
（3）HSC特異性敲除Runx2可以減少CCl4誘導(dǎo)、DDC誘導(dǎo)或MCD誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化
圖3：HSC特異性敲除Runx2可以減少CCl4誘導(dǎo)、DDC誘導(dǎo)或MCD誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化
（A） 小鼠HSC特異性敲除Runx2的構(gòu)建策略示意圖（Runx2△+HSC）。（B-C）用olive或CCl4處理HSC小鼠4周，利用Western blot和qRT-PCR分析Runx2、I型膠原和α-SMA在Runx2f+ 和Runx2△+HSC中的蛋白質(zhì)和mRNA水平（n＝3）。
（D） 用olive或CCl4處理的Runx2f+和Runx2小鼠肝臟組織中I型膠原和a-SMA的Masson和IHC染色的代表性顯微圖。比例尺：100μm（n=5）。
（E） Runx2f+和Runx2△+HSC小鼠用0.1%的DDC喂養(yǎng)4周以誘導(dǎo)膽汁淤滯，或用MCD喂養(yǎng)8周以誘導(dǎo)NASH。顯示了a-SMA的H&E、Masson和IHC染色的代表性顯微圖。比例尺：100μm（n=3）。
（4）Runx2過表達(dá)加劇了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化
圖4：Runx2過表達(dá)加劇了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化
（B-C）Western blot和qRT-PCR檢測(cè)Runx2、I型膠原和α-SMA的蛋白和mRNA表達(dá)（n=3）。
（D） 經(jīng)olive或CCl4處理的HBAAV-ctrl或HBAAV-Runx2小鼠中膠原I和a-SMA的Masson和IHC染色的代表性圖像。比例尺：100μm（n=5）。
（5）Runx2在體外調(diào)控HSC活化
圖5：Runx2在體外調(diào)控HSC活化
（A） Runx2小鼠的HSC特異性缺失策略示意圖（Runx2△/△HSC）。（B） 從Runx2△/△HSC或HBAAV-Runx2小鼠中分離出原代HSC，并在3%FBS條件下培養(yǎng)4天。
（C） 從Runx2f/f 或 Runx2△/△HSC小鼠中分離的原代HSC，通過qRT-PCR測(cè)定纖維相關(guān)基因。
（D） Runx2、α-SMA、I型膠原和TGF-β1在Runx2f/f或Runx2△/△HSC小鼠中分離的原代HSC中的Western blot分析。
（E-F）通過qRT-PCR和Western blot分析從HBAAV-ctrl或HBAAV-Runx2小鼠中分離的原代HSC中Runx2、α-SMA、I型膠原和TGF-β1的mRNA和蛋白表達(dá)。
（G-H）通過流式細(xì)胞術(shù)分析原代HSC中各個(gè)細(xì)胞周期階段的指數(shù)生長百分比。
（I） 從Runx2f/f或Runx2△/△HSC小鼠中分離的原代HSC，通過免疫熒光染色檢測(cè)α-SMA活化特征（n＝3）。
（6）Itgav是Runx2在肝纖維化中的直接下游靶點(diǎn)
圖6：Itgav(integrin alpha-V)是Runx2在肝纖維化中的直接下游靶點(diǎn)
（B） 對(duì)從HBAAV-Runx2小鼠分離的原代HSC進(jìn)行Runx2 ChIP-seq分析，并對(duì)DEG進(jìn)行KEGG通路富集分析。
（C） 通過ChIP-seq分析，對(duì)348個(gè)啟動(dòng)子與Runx2結(jié)合基因和183個(gè)TGF-β通路相關(guān)基因進(jìn)行交叉分析。
（D） 基因組圖譜顯示Itgav轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子區(qū)的Runx2結(jié)合位點(diǎn)（Chr2:8372357-83723806）。
（E） 經(jīng)pCDNA 3.1-ctrl或pCDNA 3.1-Runx2轉(zhuǎn)染的小鼠HSC細(xì)胞系上進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因分析。
（F-G） 經(jīng)CCl4處理4周的Runx2f/+、Runx2△/+HSC、HBAAV-ctrl和HBAAV-Runx2小鼠中采集肝臟組織。通過qRT-PCR和Western blot分析Itgav的mRNA和蛋白表達(dá)。
（H-I） 分別從Runx2f/f小鼠、Runx2△/△HSC小鼠、HBAAV-ctrl小鼠和HBAAV-Runx2小鼠中分離出原代HSC。用qRT-PCR分析Itgav的mRNA表達(dá)。Western blot分析Itgav及其下游激酶（FAK、pFAK、PI3K、pPI3K，Smad2/3和pSmad2/3）的蛋白表達(dá)。數(shù)據(jù)為平均值±SEM；n＝3， *p＜0.05，#p＜0.05。
（7）αv整合素抑制劑阻斷Runx2過表達(dá)引起的CCl4誘導(dǎo)肝纖維化加劇
圖7：αv整合素抑制劑阻斷Runx2過表達(dá)引起的CCl4誘導(dǎo)肝纖維化加重
（A） αv整合素抑制劑CWHM 12體外實(shí)驗(yàn)的靶向處理方案。HBAAV-ctrl小鼠或HBAAV-Runx2小鼠給予CWHM-12（100mg/kg/天）或安慰劑（載體）處理1周，然后分離原代HSC。（B-C）Western blot和qRT-PCR分析原發(fā)性HSC中α-SMA的蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)水平（n=3）。
（D） CWHM-12體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的靶向處理方案。小鼠服用CCl4 2周，然后插入含有CWHM-12（100mg/kg/天）或安慰劑（載體）的Alzet微型泵，隨后再服用2周CCl4。
（E-F）qRT-PCR和Westernblot分析檢測(cè)用或不用CWHM-12處理的HBAAV-Runx2或HBAAV-ctrl小鼠的肝臟組織中α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)（n=3）。
（G） I型膠原和α-SMA的Masson和IHC染色的代表性顯微圖。比例尺：100μm（n=5）
（8）PKA調(diào)控HSC中Runx2的活化和核轉(zhuǎn)位（nuclear translocation）
圖8：PKA介導(dǎo)的Runx2活化和HSC核轉(zhuǎn)位
（A） 經(jīng)或不經(jīng)TGF-β1（5 ng/mL）、PDGF-BB（5 ng/mL）、EGF（5 mg/mL）處理，然后用DMSO或PKA抑制劑（PKI-6-22，10 nM/mL）處理12小時(shí)的原代HSC中Runx2、α-SMA、I型膠原和Itgav的Western blot分析（n=3）。（B） 經(jīng)或不經(jīng)TGF-β1，然后用PKA活化劑（8-Bromo-cAMP，0.5 nM/mL）或抑制劑（n=3）處理的原代HSC中細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)Runx2的Western blot分析。
（C） PKA抑制劑或活化劑處理的原代HSC中Runx2和α-SMA的免疫熒光染色（n=3）。
參考文獻(xiàn)：
Zhong L, Zhao J, Huang L, Liu Y, Pang X, Zhan K, Li S, Xue Q, Pan X, Deng L. Runx2 activates hepatic stellate cells to promote liver fibrosis via transcriptionally regulating Itgav expression. Clin Transl Med. 2023 Jul;13(7):e1316.
標(biāo)簽：
ChIP-seq
- MeRIP-seq等揭示m6A甲基化及調(diào)控因子在食管胃結(jié)合部腺癌中的作用
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