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DNA低甲基化介導(dǎo)子宮肌層干細(xì)胞發(fā)育重編程的表觀遺傳機(jī)制介紹

瀏覽次數(shù)：305　發(fā)布日期：2023-9-7　 來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)
子宮肌瘤（uterine fibroids，UF）是生殖系統(tǒng)最常見的良性腫瘤，也是子宮切除手術(shù)最常見的指征。盡管患病率很高，但子宮肌瘤的確切發(fā)病機(jī)制在很大程度上仍未知。有證據(jù)表明，發(fā)育期間暴露于激素可能與子宮肌層易感UF發(fā)育有關(guān)，當(dāng)發(fā)育暴露于內(nèi)分泌干擾化學(xué)物質(zhì)（endocrine-disrupting chemical，EDC）如己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）、鄰苯二甲酸鹽（Phthalates）和大豆植物雌激素染料染料木素（genistein），會(huì)增加動(dòng)物模型中UF的發(fā)生率、多樣性和總體大小。通過充分了解環(huán)境EDC影響人類表觀基因組的機(jī)制，可以更容易地提供明確的臨床指導(dǎo)，以解決普通人群中常見的低水平暴露對健康的潛在影響。盡管子宮肌層干細(xì)胞（myometrial stem cells，MMSC）已被鑒定為UF的來源細(xì)胞，但由于發(fā)育暴露于EDC而導(dǎo)致MMSC編程的表觀遺傳機(jī)制尚未表征。
 
2023年8月31日，芝加哥大學(xué)婦產(chǎn)科Qiwei Yang為第一作者和通訊作者、Ayman Al-Hendy為共同通訊作者在《Cell Mol Life Sci》雜志發(fā)表題為“Developmental reprogramming of myometrial stem cells by endocrine disruptor linking to risk of uterine fibroids”的研究論文， 研究通過RNA-seq、ChIP-seq、RRBS、功能獲得/喪失分析和熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)，在體外和Eker大鼠模型中研究了子宮肌層干細(xì)胞（UFs的假定來源）的發(fā)育重編程，揭示了混合譜系白血病蛋白-1（mixed lineage leukemia protein-1，MLL1） / DNA低甲基化介導(dǎo)MMSC發(fā)育重編程的表觀遺傳機(jī)制。
 
標(biāo)題：Developmental reprogramming of myometrial stem cells by endocrine disruptor linking to risk of uterine fibroids（內(nèi)分泌干擾素對子宮肌層干細(xì)胞的發(fā)育重編程與子宮肌瘤風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)）
時(shí)間：2023-08-31
期刊：Cellular and Molecular Life Sciences（細(xì)胞與分子生命科學(xué)）
影響因子：IF 8 / 1區(qū)
技術(shù)平臺(tái)：ChIP-seq、RNA-seq、RRBS、Target-BS、功能獲得/喪失分析和熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)等

研究摘要：
組織和器官生長期間很容易受環(huán)境影響，但尚不清楚在此期間暴露是如何導(dǎo)致表觀基因組變化和增加子宮肌瘤（UF）等激素相關(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)。
研究通過RNA-seq、ChIP-seq、RRBS、功能獲得/喪失分析和熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)，在體外和Eker大鼠模型中研究了子宮肌層干細(xì)胞（MMSC）的發(fā)育重編程。
研究結(jié)果表明，在Eker大鼠發(fā)育過程中，當(dāng)暴露于內(nèi)分泌干擾化學(xué)物質(zhì)（endocrine-disrupting chemical，EDC）己烯雌酚時(shí)，MMSC的雌激素應(yīng)答轉(zhuǎn)錄組發(fā)生重編程。MMSC中的重編程基因被稱為雌激素應(yīng)答基因（estrogen-responsive genes，ERGs），由混合譜系白血病蛋白-1（MLL1）和DNA低甲基化機(jī)制激活。暴露于天然類固醇的Eker大鼠在發(fā)育性暴露于EDC后，MMSC中ERG表達(dá)顯著上調(diào)，從而增強(qiáng)雌激素活性。
本研究揭示了MLL1/DNA低甲基化介導(dǎo)MMSC重編程的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。EDC暴露表觀靶向MMSC，并導(dǎo)致ERG亞群表達(dá)的持續(xù)變化，在ERG上產(chǎn)生激素印記，導(dǎo)致“超雌激素”表型，并增加UFs的激素依賴性風(fēng)險(xiǎn)。
 
圖1：實(shí)驗(yàn)圖
 
Eker大鼠幼崽在出生后10-12天暴露于VEH（每天皮下注射50μl芝麻籽油，vehicle，n=5）和EDC（每天皮下注射10μg己烯雌酚，n=5）。幼崽在5月齡時(shí)被處死，代表早期成年期。從大鼠中分離出子宮肌層組織，并使用Stro-1/CD44表面標(biāo)記進(jìn)行MMSC分離。利用多組學(xué)分析，包括RNA-seq、ChIP-seq和RRBS，分別鑒定轉(zhuǎn)錄組、組蛋白修飾和DNA甲基化的整體變化。同時(shí)還進(jìn)行目標(biāo)基因的亞硫酸鹽NGS測序（Target-BS），以檢測基因CpG島的DNA甲基化。

研究結(jié)果
（1）Eker大鼠EDC暴露與VEH暴露MMSC中差異轉(zhuǎn)錄模式的鑒定

圖2：發(fā)育性EDC誘導(dǎo)大鼠MMSC基因重編程
  1. EDC己烯雌酚組和VEH組的各5只動(dòng)物混樣，采用FACS策略進(jìn)行MMSC分離。餅圖顯示通過RNA-seq檢測的EDC -MMSC和VEH-MMSC之間的RNA表達(dá)變化基因百分比；FDR<0.05時(shí)臨界值為兩倍。
  2. EDC-MMSC與VEH-MMSC中排名前20位的up-DEG列表。
  3. EDC-MMSC與VEH-MMSC中排名前20位的down-DEG列表。
  4. 過表達(dá)分析表明，包括雌激素反應(yīng)通路（紅色）在內(nèi)的多種UF相關(guān)通路受早期EDC暴露影響。
  5. 通過Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析發(fā)育性EDC己烯雌酚暴露對相關(guān)疾病的影響，用紅色突出顯示

（2）發(fā)育性EDC暴露重編程MMSC中的雌激素應(yīng)答基因
圖3：轉(zhuǎn)錄譜分析顯示雌激素應(yīng)答基因的重編程
  1. RNA-seq分析，與VEH-MMSCs相比，EDC-MMSC中RNA表達(dá)變化的ERG百分比餅圖。
  2. 在EDC-MMSC與VEH-MMSC中RNA-seq分析顯示差異表達(dá)的前20個(gè)up-ERG列表。
  3. 在EDC-MMSC與VEH-MMSC中RNA-seq分析顯示差異表達(dá)的前20個(gè)down-ERG列表。
  4. 與VEH-MMSC相比，EDC-MMSC中的ER-a表達(dá)上調(diào)。從EDC-MMSC和VEH-MMSC制備裂解液，并使用ER-a抗體進(jìn)行Western blot分析。
  5. 比較EDC-MMSC和VEH-MMSC在有或無雌激素（10nM）時(shí)的螢光素酶活性。
  6. DES（己烯雌酚，diethylstilbestrol）-MMSC和VEH-MMSC中有或無雌激素時(shí)ERG表達(dá)變化。學(xué)生t檢驗(yàn)，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001
 
（3）EDC暴露激活MLL1表觀遺傳通路并通過H3K4me3破壞MMSC的表觀基因組

圖4：EDC發(fā)育性暴露激活MLL1
  1. 用抗MLL1、H3K4me3和Cd9抗體進(jìn)行Western blotting以分析MLL1C（MLL1活化形式）、H3K4me3和Cd9水平�？侶3和β-肌動(dòng)蛋白用作負(fù)載對照。生物學(xué)重復(fù)（n=3）進(jìn)行定量。
  2. EDC-MMSC與VEH-MMSC中H3K4me3染色和定量分析的共聚焦成像圖（Confocal imaging）。使用三個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞蓋片進(jìn)行定量。學(xué)生t檢驗(yàn)，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
圖5：EDC暴露破壞MMSC的表觀基因組
  1. ERG peaks數(shù)量餅圖。
  2. EDC暴露將H3K4me3與ERG RNA表達(dá)整合。
  3. EDC調(diào)控H3K4me3 peaks的ERG。
  4. Integrative Genomics Viewer直方圖顯示Esr-1、Cxcl12、Cd9、Mpped2和Tgm2中的H3K4me3占比（左側(cè)panel）。對于每個(gè)基因，上方和下方的瀏覽器圖像顯示VEH-MMSC（藍(lán)色軌跡）和EDC-MMSC（紅色軌跡）中H3K4me3 peaks分布的選定區(qū)域的擴(kuò)展視圖。中間panel：通過ChIP-qPCR對H3K4me3靶基因進(jìn)行定向ChIP測序驗(yàn)證。右側(cè)panel；通過q-PCR進(jìn)行RNA測序驗(yàn)證。學(xué)生t檢驗(yàn)，*p<0.05，**p<0.01，***p < 0.001
 
圖6：Tasp1敲除逆轉(zhuǎn)了EDC暴露誘導(dǎo)的重編程ERG
  1. 在EDC-MMSC中使用shRNA慢病毒（pLKD-TASP1）質(zhì)粒敲低TASP1表達(dá)后，進(jìn)行Western blot分析以確定TASP1在MLL1介導(dǎo)的表觀遺傳學(xué)通路中的作用。分別使用抗TASP1、H3K4me3和CD9抗體進(jìn)行Western blot分析TASP1、H3K4me3、和CD9蛋白的表達(dá)水平（左圖）。生物學(xué)重復(fù)（n=3）用于定量。使用Image J（右圖）進(jìn)行定量分析。
  2. EDC暴露誘導(dǎo)的6個(gè)重編程ERG（Esr-1、Pgr、Cxcl12、Ar、Cd9和Tgm2）表達(dá)上調(diào)被EDC-MMSC中Tasp1敲除所逆轉(zhuǎn)。通過qPCR檢測EDC-MMSC炒慢病毒（scrambled lentivirus）感染或三種不同個(gè)體Tasp1敲低慢病毒的ERG RNA表達(dá)。*p<0.05，**p<0.01，***p < 0.001；學(xué)生t檢驗(yàn)

（4）EDC暴露重編程甲基化并導(dǎo)致ERG表達(dá)變化。

圖7：發(fā)育性EDC暴露誘導(dǎo)甲基化組變化并通過DNA啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致ERG重編程
  1. Western blot分析檢測VEH-MMSC和EDC-MMSC中DNMT3A的蛋白水平。
  2. VEH-MMSC和EDC-MMSC中DNA甲基化基因熱圖。
  3. 通過靶向亞硫酸鹽NGS檢測Esr1的甲基化分布，覆蓋其CpG島上的14個(gè)CpG位點(diǎn)。
  4. 具有H3K4me3和DNA甲基化狀態(tài)的EDC調(diào)控基因百分比。
  5. 具有H3K4me3和DNA甲基化狀態(tài)的基因數(shù)量。
  6. 綜合基因組查看器（IGV）圖和整合多組學(xué)分析。EDC-MMSC中H3K4me3富集、DNA甲基化和RNA表達(dá)peaks用紅色表示，而VEH-MMSC中的H3K4me3富集、DNA甲基化和RNA表達(dá)peaks用藍(lán)色表示。學(xué)生t檢驗(yàn)，***p<0.001
圖8：DES-MMSC中ERG的特異性重編程影響差異子宮肌層細(xì)胞（differential myometrial cells，DMC)
  1. DES-MMSC和DES-DMC之間的ERG（包括Bcl11b、Cd9、Cxcl12和Tgm2）差異表達(dá)條形圖。
  2. H3K4me3狀態(tài)與MMSC和DMC之間重編程ERG的比較表達(dá)相關(guān)性，以VEH-MMSC為參考。p值顯示Stro-1/CD44雙陽性和雙陰性細(xì)胞之間基因表達(dá)的顯著差異。淺藍(lán)色背景的基因表明基因表達(dá)的兩個(gè)比較（Stro-1/CD44雙陽性細(xì)胞 vs 雙陰性細(xì)胞，或Stro-1+/CD44+-DES vs VEH）呈負(fù)相關(guān)。白色背景基因表明兩個(gè)比較呈正相關(guān)。
  3. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)示意圖。從EDC-MMSC和VEH-MMSC中制備無血清條件培養(yǎng)基（CM）。來自成年大鼠子宮肌層的DMC，分別在EDC-MMSC和VEH-MMSC的CM中培養(yǎng)2天。
  4. MTT檢測EDC-MMSC和VEH-MMSC的CM對DMC增殖的作用。
  5. qPCR檢測EDC-MMSC和VEH-MMSC的CM對DMC中β-catenin和β-catenin調(diào)控基因（Angpt2、Med12l和Pitx2）表達(dá)的影響。*p<0.05，**p<0.01，***p < 0.0001

研究結(jié)論
本研究通過RNA-seq、ChIP-seq、RRBS、功能獲得/喪失分析和熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)等多組學(xué)分析，表明了外源性雌激素（EDC）直接靶向并影響MMSC的表觀遺傳學(xué)，而MMSC是UF的細(xì)胞來源。通過表觀基因組分析揭示了調(diào)控MMSC轉(zhuǎn)錄譜機(jī)制的新見解。早期暴露于EDC（如DES）會(huì)導(dǎo)致MMSC中組蛋白和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的多種基因表達(dá)模式發(fā)生顯著變化，包括各種雌激素應(yīng)答基因（ERG）。這些基因表達(dá)的變化改變了MMSC表征，導(dǎo)致“超雌激素（hyper-estrogenic）”表型，其特征是DNA修復(fù)能力降低和激素依賴性子宮疾�。ㄈ鏤Fs）的風(fēng)險(xiǎn)增加。
 
圖9：MMSC表觀基因組發(fā)育重編程模型
 
環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素（包括EDC暴露）通過組蛋白修飾和DNA甲基化破壞表觀基因組，從而導(dǎo)致MMSC向UF起始細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并最終導(dǎo)致UF形成

參考文獻(xiàn)：
Yang Q, Ali M, Treviño LS, Mas A, Al-Hendy A. Developmental reprogramming of myometrial stem cells by endocrine disruptor linking to risk of uterine fibroids. Cell Mol Life Sci. 2023 Aug 31;80(9):274.
來源：深圳市易基因科技有限公司
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