原代細(xì)胞分離培養(yǎng)常用方法及步驟介紹
原代細(xì)胞分離常采用的方法有以下兩種：
一、懸浮細(xì)胞的分離方法
1、將血液、羊水、胸水或腹水等懸液直接轉(zhuǎn)至離心管中，1000rpm/min 的低速離心 5 分鐘；
2、去掉上清，離心沉淀用無鈣、鎂的 PBS 清洗后 1000rpm/min 離心 5 分鐘。此步重復(fù)兩次；
3、用培養(yǎng)基重懸，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后分瓶培養(yǎng)；
4、如選用懸液中某種細(xì)胞，可采用離心后的細(xì)胞分層液收獲目的細(xì)胞。
二、機(jī)械分散法
適合的組織：纖維成分很少的腦組織、部分胚胎組織、以及一些腫瘤組織等，但是這一方法對(duì)組織的損傷較大。
過程：用 PBS 清洗兩次后，
（1）剪刀剪碎切后用吸管反復(fù)吹打，分散組織細(xì)胞；
（2）將已充分剪碎分散的組織放在注射器內(nèi) （用九號(hào)針），使細(xì)胞通過針頭壓出；
（3）或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠 （常用注射器鈍端） 使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。
原代細(xì)胞培養(yǎng)最基本和最常用的是組織塊法和消化法組織塊培養(yǎng)：處死動(dòng)物，無菌取組織塊入校燒杯內(nèi)，用尖嘴眼科剪刀將組織塊剪碎，吸管吸取 PBS 液沖下剪刀上的碎片，補(bǔ)加 PBS,用吸管輕輕吹打，低速離心，棄去上清液，留下組織塊，然后接種于培養(yǎng)瓶。
消化培養(yǎng)：用消化液將妨礙細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)包括基質(zhì)、纖維等去除，使組織松散、細(xì)胞分散形成懸液。
消化過程中常用的消化液：
1、胰蛋白酶
胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反應(yīng)不一樣。
在 pH 為 8.0 、溫度為 37℃ 時(shí)，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。
2、膠原酶
膠原酶（collagenase）是從溶組織梭狀細(xì)胞芽孢桿菌提取制備的，主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分。當(dāng)擬消化的組織較硬，內(nèi)含較多結(jié)締組織或膠原成分時(shí)，用胰蛋白酶解離細(xì)胞的效果較差，這時(shí)可采用膠原酶解離細(xì)胞法。
膠原酶僅對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對(duì)上皮細(xì)胞影響不大。因此適于消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細(xì)胞與膠原成分分離而不受損害。
膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細(xì)胞專用膠原酶，要根據(jù)所要分離消化的組織類型選擇膠原酶類型。
a、膠原酶Ⅰ用于上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的分離。用于消化組織中連接部分使其成為單個(gè)細(xì)胞，用于哺乳動(dòng)細(xì)胞的分離；
b、膠原酶Ⅱ適用于肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織；
c、膠原酶Ⅳ包含至少 7 種蛋白酶成分，分子量從 68-130KD 不等。它能消化多種組織；
d、膠原酶Ⅴ包含至少 7 種蛋白酶成分，分子量從 68-130KD 不等。它可用于胰腺小島組織的分離，將結(jié)締組織分離成單個(gè)細(xì)胞。
下面讓我們舉幾個(gè)實(shí)例：
正常大鼠心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)（組織塊法）：
1、將取出的心臟組織至于無菌的培養(yǎng)皿中用含雙抗的 1×PBS（pH=7.4）清洗若干次至無明顯血細(xì)胞；
2、剪開心臟組織的心房和心室部分，用含雙抗的 1×PBS（pH=7.4）清洗若干次以去除心臟內(nèi)部的大部分血液；
3、將清洗好的心臟組織剪成 2 mm3 大小，加入含雙抗的 1×PBS（pH=7.4）清洗；然后轉(zhuǎn)入 15 ml 離心管，300r/min，離心 3 min 后棄上清液。重復(fù) 2-3 次，直至離心后的液體中觀察不到明顯的紅色。
4、將清洗好的組織塊重新轉(zhuǎn)至無菌的培養(yǎng)皿中，用無菌的 200 ml 的吸頭將組織塊貼于 T-25 培養(yǎng)瓶中；
5、加入 2 ml 培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶倒置放于 37℃、5% CO2 的培養(yǎng)箱中 2-3 h 之后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。
大鼠腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)（消化法）：
1、無菌條件下摘取大鼠腎臟，于盛有含雙抗的 1×PBS（pH7.4）的培養(yǎng)皿中沖洗，用眼科剪將腎臟被膜充分剝離。
2、去掉腎髓質(zhì)，切取外層皮質(zhì)于培養(yǎng)皿中，并用眼科剪將其剪碎至 1 mm3 左右大小。
3、用含雙抗的 1×PBS（pH7.4）充分沖洗 2-3 次。
4、腎小管節(jié)段至離心管中離心 300rpm 3 min.
5、棄上清，沉淀加入 0.25% 胰蛋白酶，置于 37℃ 水浴鍋中消化 20 min.
6、加入 1 mlFBS 終止反應(yīng)。
7、取上清液，過 200 目網(wǎng)篩后收集液體，于 1000rpm 離心 5 min.
8、棄去上清，收集沉淀，加入培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞重懸。
9、將細(xì)胞以合適的數(shù)量接種于培養(yǎng)瓶中。
10、將細(xì)胞放入 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，并于 72 h 后進(jìn)行首次換液，以后每 48 h 換一次液，直至細(xì)胞匯合鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶。
當(dāng)然，實(shí)際操作過程中，有時(shí)候一些細(xì)微的疏忽或差異都有可能影響到細(xì)胞的狀態(tài)。我們很多人都遇到過這樣的情況，當(dāng)你花了很多心血分離或培養(yǎng)一瓶原代細(xì)胞，到了關(guān)鍵時(shí)刻它卻棄你而去，絲毫不管不顧你的論文截止時(shí)間已經(jīng)近在眼前，當(dāng)你欲哭無淚肝腸寸斷的時(shí)候，請(qǐng)不要忘了你還可以直接從專業(yè)機(jī)構(gòu)購買原代細(xì)胞。目前市面上已經(jīng)有不少提供優(yōu)質(zhì)原代細(xì)胞的專業(yè)技術(shù)企業(yè)，有些還提供配套的技術(shù)服務(wù)，不失為一個(gè)解決問題的好途徑。
一、懸浮細(xì)胞的分離方法
1、將血液、羊水、胸水或腹水等懸液直接轉(zhuǎn)至離心管中，1000rpm/min 的低速離心 5 分鐘；
2、去掉上清，離心沉淀用無鈣、鎂的 PBS 清洗后 1000rpm/min 離心 5 分鐘。此步重復(fù)兩次；
3、用培養(yǎng)基重懸，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后分瓶培養(yǎng)；
4、如選用懸液中某種細(xì)胞，可采用離心后的細(xì)胞分層液收獲目的細(xì)胞。
二、機(jī)械分散法
適合的組織：纖維成分很少的腦組織、部分胚胎組織、以及一些腫瘤組織等，但是這一方法對(duì)組織的損傷較大。
過程：用 PBS 清洗兩次后，
（1）剪刀剪碎切后用吸管反復(fù)吹打，分散組織細(xì)胞；
（2）將已充分剪碎分散的組織放在注射器內(nèi) （用九號(hào)針），使細(xì)胞通過針頭壓出；
（3）或在不銹鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠 （常用注射器鈍端） 使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。
原代細(xì)胞培養(yǎng)最基本和最常用的是組織塊法和消化法組織塊培養(yǎng)：處死動(dòng)物，無菌取組織塊入校燒杯內(nèi)，用尖嘴眼科剪刀將組織塊剪碎，吸管吸取 PBS 液沖下剪刀上的碎片，補(bǔ)加 PBS,用吸管輕輕吹打，低速離心，棄去上清液，留下組織塊，然后接種于培養(yǎng)瓶。
消化培養(yǎng)：用消化液將妨礙細(xì)胞生長的細(xì)胞間質(zhì)包括基質(zhì)、纖維等去除，使組織松散、細(xì)胞分散形成懸液。
消化過程中常用的消化液：
1、胰蛋白酶
胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反應(yīng)不一樣。
在 pH 為 8.0 、溫度為 37℃ 時(shí)，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。
2、膠原酶
膠原酶（collagenase）是從溶組織梭狀細(xì)胞芽孢桿菌提取制備的，主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分。當(dāng)擬消化的組織較硬，內(nèi)含較多結(jié)締組織或膠原成分時(shí)，用胰蛋白酶解離細(xì)胞的效果較差，這時(shí)可采用膠原酶解離細(xì)胞法。
膠原酶僅對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有消化作用而對(duì)上皮細(xì)胞影響不大。因此適于消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，可使上皮細(xì)胞與膠原成分分離而不受損害。
膠原酶分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型以及肝細(xì)胞專用膠原酶，要根據(jù)所要分離消化的組織類型選擇膠原酶類型。
a、膠原酶Ⅰ用于上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的分離。用于消化組織中連接部分使其成為單個(gè)細(xì)胞，用于哺乳動(dòng)細(xì)胞的分離；
b、膠原酶Ⅱ適用于肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織；
c、膠原酶Ⅳ包含至少 7 種蛋白酶成分，分子量從 68-130KD 不等。它能消化多種組織；
d、膠原酶Ⅴ包含至少 7 種蛋白酶成分，分子量從 68-130KD 不等。它可用于胰腺小島組織的分離，將結(jié)締組織分離成單個(gè)細(xì)胞。
下面讓我們舉幾個(gè)實(shí)例：
正常大鼠心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng)（組織塊法）：
1、將取出的心臟組織至于無菌的培養(yǎng)皿中用含雙抗的 1×PBS（pH=7.4）清洗若干次至無明顯血細(xì)胞；
2、剪開心臟組織的心房和心室部分，用含雙抗的 1×PBS（pH=7.4）清洗若干次以去除心臟內(nèi)部的大部分血液；
3、將清洗好的心臟組織剪成 2 mm3 大小，加入含雙抗的 1×PBS（pH=7.4）清洗；然后轉(zhuǎn)入 15 ml 離心管，300r/min，離心 3 min 后棄上清液。重復(fù) 2-3 次，直至離心后的液體中觀察不到明顯的紅色。
4、將清洗好的組織塊重新轉(zhuǎn)至無菌的培養(yǎng)皿中，用無菌的 200 ml 的吸頭將組織塊貼于 T-25 培養(yǎng)瓶中；
5、加入 2 ml 培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶倒置放于 37℃、5% CO2 的培養(yǎng)箱中 2-3 h 之后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。
大鼠腎小管上皮細(xì)胞培養(yǎng)（消化法）：
1、無菌條件下摘取大鼠腎臟，于盛有含雙抗的 1×PBS（pH7.4）的培養(yǎng)皿中沖洗，用眼科剪將腎臟被膜充分剝離。
2、去掉腎髓質(zhì)，切取外層皮質(zhì)于培養(yǎng)皿中，并用眼科剪將其剪碎至 1 mm3 左右大小。
3、用含雙抗的 1×PBS（pH7.4）充分沖洗 2-3 次。
4、腎小管節(jié)段至離心管中離心 300rpm 3 min.
5、棄上清，沉淀加入 0.25% 胰蛋白酶，置于 37℃ 水浴鍋中消化 20 min.
6、加入 1 mlFBS 終止反應(yīng)。
7、取上清液，過 200 目網(wǎng)篩后收集液體，于 1000rpm 離心 5 min.
8、棄去上清，收集沉淀，加入培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞重懸。
9、將細(xì)胞以合適的數(shù)量接種于培養(yǎng)瓶中。
10、將細(xì)胞放入 37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，并于 72 h 后進(jìn)行首次換液，以后每 48 h 換一次液，直至細(xì)胞匯合鋪滿整個(gè)培養(yǎng)瓶。
當(dāng)然，實(shí)際操作過程中，有時(shí)候一些細(xì)微的疏忽或差異都有可能影響到細(xì)胞的狀態(tài)。我們很多人都遇到過這樣的情況，當(dāng)你花了很多心血分離或培養(yǎng)一瓶原代細(xì)胞，到了關(guān)鍵時(shí)刻它卻棄你而去，絲毫不管不顧你的論文截止時(shí)間已經(jīng)近在眼前，當(dāng)你欲哭無淚肝腸寸斷的時(shí)候，請(qǐng)不要忘了你還可以直接從專業(yè)機(jī)構(gòu)購買原代細(xì)胞。目前市面上已經(jīng)有不少提供優(yōu)質(zhì)原代細(xì)胞的專業(yè)技術(shù)企業(yè)，有些還提供配套的技術(shù)服務(wù)，不失為一個(gè)解決問題的好途徑。
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