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代謝組學(xué)探究金納米球GNS調(diào)節(jié)TMAO代謝抗骨質(zhì)疏松中的應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：645　發(fā)布日期：2023-9-20　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

文章標(biāo)題：Gold-nanosphere mitigates osteoporosis through regulating TMAO metabolism in a gut microbiota-dependent manner

發(fā)表期刊：Journal of Nanobiotechnology
影響因子：10.2
客戶單位：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
百趣提供服務(wù)：氧化三甲胺高通量靶標(biāo)

研究背景

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis, OP)是一種代謝性骨病，其特征是骨量減少和骨脆性增加。金納米球(Gold nanospheres, GNS)作為一種常見(jiàn)的金納米顆粒，具有顯著的抗菌抗炎活性，已被應(yīng)用于治療眼疾病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。然而，GNS對(duì)骨質(zhì)疏松癥的影響仍不明確。有研究表明腸道微生物群可能參與調(diào)節(jié)骨代謝和骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)展，且氧化三甲胺(Trimethylamine N-oxide, TMAO)參與了骨骼健康的維持，但其潛在機(jī)制尚不清楚。卵巢切除術(shù)(ovariectomy, OVX)誘導(dǎo)的小鼠骨質(zhì)疏松癥模型已被廣泛用于模擬骨質(zhì)疏松癥的典型臨床表型，因此本研究采用OVX骨質(zhì)疏松小鼠來(lái)研究GNS是否對(duì)骨質(zhì)疏松癥有治療作用。作者結(jié)合腸道微生物測(cè)序和氧化三甲胺的檢測(cè)，證明了GNS作為腸道微生物群調(diào)節(jié)劑對(duì)骨質(zhì)疏松癥有保護(hù)作用，并為“腸-骨”軸的調(diào)節(jié)提供了新的見(jiàn)解。

圖1. 研究流程

研究結(jié)果

01 GNS給藥減輕OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥的病理特征
組織學(xué)分析結(jié)果顯示，GNS給藥對(duì)小鼠的腎臟和肝臟沒(méi)有不良影響，并具有良好的生物相容性。對(duì)股骨小梁和皮質(zhì)骨的輪廓進(jìn)行µCT分析圖像表明，GNS給藥能夠減輕OVX小鼠的骨丟失（圖2 B）。GNS給藥顯著增加了骨體積/組織比、骨小梁數(shù)量和骨小梁厚度，并減少了骨小梁分離（圖2 C-F）。有趣的是，兩組之間的骨密度沒(méi)有顯著差異（圖2 G）。測(cè)試皮質(zhì)骨的相關(guān)指標(biāo)，包括皮質(zhì)骨厚度和皮質(zhì)骨面積都沒(méi)有顯著差異。血清中的Ⅰ型膠原C端肽(C-telopeptide of type I collagen, CTX-1)被認(rèn)為是反映骨減少進(jìn)展的相關(guān)生物標(biāo)志物。因此，測(cè)量血清中CTX-1的濃度，發(fā)現(xiàn)GNS給藥顯著降低了CTX-1水平，進(jìn)一步表明GNS對(duì)骨丟失的保護(hù)作用（圖2 J）。這些結(jié)果表明，GNS給藥顯著改善了OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥。

圖2. GNS給藥改善了OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥

02 GNS以腸道微生物群依賴的方式減輕OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥
在GNS給藥前使用四種抗生素混合物進(jìn)行了偽無(wú)菌小鼠模型構(gòu)建（圖3 A）。µCT分析表明，ABX(OVX)組與ABX(OVX+GNS)組幾乎無(wú)法區(qū)分（圖3 B）。另外GNS給藥對(duì)骨質(zhì)疏松癥的有益作用包括：骨體積比、骨小梁數(shù)量、厚度、分離度、骨皮質(zhì)厚度及CTX-1的改變，在沒(méi)有腸道微生物的情況下被完全消除（圖3 C-J）。

圖3. GNS給藥對(duì)OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥的保護(hù)作用在腸道微生物群耗竭后消失

通過(guò)糞菌移植(Fecal microbiota transplantation, FMT)方式，隔天灌胃將OVX和OVX+GNS組的微生物群移植到腸道微生物群缺失的野生型小鼠中（圖4 A）。FMT(OVX+GNS)組的骨密度和皮質(zhì)骨面積與FMT(OVX)組相比顯著增加（圖4G、I），但其他指標(biāo)和µCT圖像顯示兩組之間沒(méi)有顯著差異（圖4B-F、H）。這些不顯著的差異結(jié)果可能是由于FM移植實(shí)驗(yàn)中腸道微生物群的損失導(dǎo)致。這些結(jié)果表明，GNS是以腸道微生物依賴的方式減輕了OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥。

圖4. 糞便微生物群移植減輕OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松

03 GNS給藥顯著改變了腸道微生物群的多樣性
進(jìn)一步使用糞便中細(xì)菌的16S r測(cè)序分析研究了GNS對(duì)腸道微生物群多樣性和組成的調(diào)節(jié)作用。如圖5A所示，OVX和OVX+GNS組的糞便中共獲得6124個(gè)菌，其中1403個(gè)菌在兩組中共有。通過(guò)主坐標(biāo)分析(PCoA)顯示，兩組之間明顯分離，表明OVX+GNS和OVX組的微生物群組成不同（圖5 B-D）。

為了研究?jī)山M之間腸道微生物群的具體變化，在不同水平上評(píng)估了每組分類群的相對(duì)豐度。如圖5F和5G所示，擬桿菌門和厚壁菌門為兩大優(yōu)勢(shì)門，有趣的是，OVX+GNS組中厚壁菌門與擬桿菌門的比例顯著高于OVX組，表明擬桿菌門對(duì)GNS的敏感性更高。此外，GNS給藥顯著降低了擬桿菌門的水平，但增加了變形菌門和ℇ變形菌門的水平（圖5 H）。

圖5. GNS給藥顯著改變了腸道微生物群的多樣性

進(jìn)一步分析屬水平的物種分布，發(fā)現(xiàn)這兩組在腸道微生物群中表現(xiàn)出明顯差異（圖6 A-B）。幽門螺桿菌屬和乳酸桿菌屬在GNS給藥的小鼠中占據(jù)相對(duì)較高的比例，而擬普雷沃氏菌屬在OVX+GNS組中顯示出較少的豐度（圖6 C-E）。通過(guò)LEfSe和分支圖分析結(jié)果表明，普雷沃氏菌科、擬桿菌門和真桿菌屬是OVX組中促進(jìn)腸道菌群失調(diào)的重要細(xì)菌類型。此外，乳桿菌目、螺旋桿菌科、科氏菌目、水藻科、放線菌門和變形菌門在OVX+GNS組中有相對(duì)較高的豐度，這可能是GNS介導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥緩解的關(guān)鍵細(xì)菌（圖6 F-G）。通過(guò)熱圖分析，乳桿菌屬和幽門螺桿菌屬在OVX+GNS組中顯著富集，而異普雷沃菌屬和擬桿菌目在OVX組中所占比例更高，這與LEfSe分析結(jié)果一致（圖6 H）�？傊珿NS給藥影響了腸道菌群的多樣性組成。

圖6. 屬分類水平上OVX和OVX+GNS組的糞便微生物群組成

04 GNS給藥降低了TMAO的豐度
為了探究腸道微生物群的改變是否影響TMAO的產(chǎn)生，作者進(jìn)行了代謝組學(xué)分析。與微生物多樣性結(jié)果一致，OVX+GNS和OVX組具有不同的TMAO特征。在這些代謝產(chǎn)物中，OVX+GNS組的TMA、L-肉堿和TMAO的含量較低。與OVX組相比，OVX+GNS組的總TMAO相關(guān)代謝產(chǎn)物在糞便中顯著減少（圖7 A-B）。

為了確定TMAO水平的變化是否與GNS治療誘導(dǎo)的腸道菌群改變密切相關(guān)，我們?cè)贔MT組之間進(jìn)行了針對(duì)性的TMAO定量分析。OPLS-DA和PCA分析結(jié)果表明兩組之間明顯分離。FMT(OVX+GNS)中TMAO相關(guān)代謝物的產(chǎn)生也顯著低于FMT(OVX)組（圖7 C）。FMT(OVX+GNS)組的肌酸酐和氧化三甲胺濃度顯著低于FMT(OVX)組。總之，GNS給藥通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物群的多樣性來(lái)降低代謝產(chǎn)物TMAO的豐度。

圖7. GNS給藥減少了腸道微生物群的TMAO相關(guān)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生

為了更好地確定腸道微生物群和代謝產(chǎn)物TMAO之間的聯(lián)系，作者進(jìn)行了腸道微生物組和代謝組的聯(lián)合分析。如關(guān)聯(lián)分析熱圖所示，17個(gè)屬與TMAO相關(guān)代謝產(chǎn)物具有顯著相關(guān)性，其中12個(gè)屬與TMAO相關(guān)代謝產(chǎn)物呈正相關(guān)，5個(gè)屬呈負(fù)相關(guān)。接著為了進(jìn)一步展示腸道微生物菌與TMAO相關(guān)代謝產(chǎn)物之間的相關(guān)性，作者根據(jù)17個(gè)屬和TMAO代謝產(chǎn)物構(gòu)建了一個(gè)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖（圖8 B）�？傊@些結(jié)果提供了腸道微生物群和TMAO代謝產(chǎn)物之間的關(guān)系，這有助于進(jìn)一步的體外研究。

圖8. 腸道微生物組和代謝組的聯(lián)合分析

05 GNS抑制促炎細(xì)胞因子的釋放減輕OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松
骨質(zhì)疏松癥是一種慢性炎癥性疾病，其中IL-1、IL-6和TNF-α等促炎細(xì)胞因子通過(guò)促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和活化以及抑制成骨細(xì)胞分化來(lái)加速骨丟失。此外，TMAO水平已被證明與促炎細(xì)胞因子水平的增加有關(guān)。進(jìn)行了細(xì)胞因子微陣列分析，以探討GNS是否誘導(dǎo)血清中不同細(xì)胞因子的改變。如熱圖所示，與OVX組相比，OVX+GNS組的促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和G-CSF顯著降低（圖9 A）�；鹕綀D顯示GNS誘導(dǎo)的差異表達(dá)細(xì)胞因子與熱圖一致（圖9 B）。總之，GNS給藥顯著下調(diào)了促炎細(xì)胞因子的釋放，這可能與TMAO的減少有關(guān)（圖10）。

圖9. GNS治療顯著改變了OVX小鼠的炎癥細(xì)胞因子譜

圖10. GNS通過(guò)調(diào)節(jié)微生物群穩(wěn)態(tài)及相關(guān)TMAO代謝對(duì)OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥的保護(hù)作用機(jī)制示意圖

研究結(jié)論
本研究發(fā)現(xiàn)GNS可以以腸道微生物群依賴的方式顯著減輕OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥。GNS給藥調(diào)節(jié)了骨質(zhì)疏松癥相關(guān)腸道微生物群的多樣性，并降低了TMAO相關(guān)代謝產(chǎn)物的豐度，從而進(jìn)一步降低了骨代謝中促炎細(xì)胞因子的水平，最終改善了骨質(zhì)疏松癥狀。另外進(jìn)行了FMT來(lái)證明這種腸道菌群依賴性機(jī)制。綜上，GNS可以通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物群有效改善骨質(zhì)疏松癥，這可能是一種新的、有前景的治療骨質(zhì)疏松的藥物。

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