RNA-seq技術(shù)探究從牛膝中分離得到的果膠多糖被人體腸道擬桿菌代謝

期刊：Int J Biol Macromol
影響因子：8.2
伯豪技術(shù)服務(wù)：RNA-seq

導語
牛膝是治療骨質(zhì)疏松癥的著名中藥。多糖是形成腸道微生物群的主要因素，是雙棱草的主要成分。然而，雙歧桿菌多糖對人體腸道菌群的生物活性尚不清楚。本文從苦參中提取并純化了平均分子量為93.085 kDa的果膠多糖A23-1。A23-1由鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成。GC-MS、部分酸水解和NMR結(jié)果表明，A23-1的主鏈由1,2,4 - rhap和1,4 - glapa組成，分支由半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸組成。進一步，發(fā)現(xiàn)A23-1被降解為單糖和片段。以擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron, BT)為模型，提出3個多糖利用位點(PULs)可能參與了A23-1的降解。BO產(chǎn)生的降解產(chǎn)物可能不支持益生菌的生長。此外，擬桿菌和益生菌利用A23-1生成乙酸酯和丙酸酯為主要終產(chǎn)物。這些發(fā)現(xiàn)提示A23-1可能是人類腸道擬桿菌的食物來源之一。

研究技術(shù)
NMR、GC-MS
RNA-seq（伯豪生物提供技術(shù)服務(wù)）

技術(shù)路線

研究結(jié)果
A23-1是一種來自牛膝的同質(zhì)多糖。根據(jù)單糖分析、甲基化分析和部分水解結(jié)果，可以推斷A23-1可能是一種典型的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖（RG I型果膠）。對A23-1進行NMR分析，A23–1含有相似含量的鼠李糖(7.26%)和半乳糖酸(5.12%)，經(jīng)過部分酸水解后，它們的比例穩(wěn)步上升。

1. 人類腸道擬桿菌將A23-1降解為片段和單糖
分析了A23-1對BT、BO、BC、BX和Bca的生物活性，發(fā)現(xiàn)這些擬桿菌在2.5 mg/mL的A23-1上生長良好，而在5 mg/mL的A23-1存在下，所有菌株都生長良好，尤其是BT。A23-1被降解成兩個片段，而不同的擬桿菌降解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了不同的單糖成分。A23-1不能顯著促進益生菌的生長。A23–1可能被降解以支持擬桿菌的生長。
 

圖1 測定了HGM在A23-1及其降解產(chǎn)物的生長曲線

2. 三個PULs可能參與了A23–1的降解
對在含有A23-1或葡萄糖的MM培養(yǎng)基上生長的BT進行了RNA-seq。結(jié)果顯示，大多數(shù)基因與碳水化合物代謝相關(guān)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，總共有394個基因在BT生長于A23-1時表現(xiàn)出表達變化。在394個上調(diào)基因中，有19個與BT在葡萄糖上生長相比表現(xiàn)出大量增加。這19個上調(diào)基因被分為3個離散的PULs，并通過qPCR證實。為了更好地顯示這些PULs，根據(jù)Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482(Geneback accession number: AE015928.1)的基因注釋，繪制了每個PUL的示意圖。PUL1由10個基因組成，編碼假設(shè)蛋白和兩對SusC和SusD。PUL2由5個基因組成，編碼假設(shè)蛋白。PUL3由4個基因組成，參與鼠李糖代謝。本研究中的PULs與典型的PUL不同，后者包含SGBP、SusC和SusD、糖苷水解和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子。這些PUL中編碼的大多數(shù)蛋白是假設(shè)蛋白，這與以前的報告不同。研究這些假設(shè)蛋白質(zhì)的功能可能具有重要意義，但它們的詳細功能應該在未來得到解決。
 

3. 卵形擬桿菌(Bacteroides ovatus)產(chǎn)生的A23-1降解產(chǎn)物可能不支持益生菌的生長
在添加或不添加碳源的條件下，分析了BO和益生菌在MCB培養(yǎng)基中的生長情況。結(jié)果顯示，在添加5mg/mL葡萄糖的條件下，BO和益生菌的生長良好，OD600值超過0.5；而在不添加碳源的條件下，它們的OD600值不到0.4。在添加A23-1的情況下，我們發(fā)現(xiàn)BO作為單一菌種可以在A23-1上生長良好，最大OD600值約為0.5，而益生菌作為單一菌種在A23-1上的生長不佳，尤其是LR。BO和益生菌的混合培養(yǎng)物的OD600值介于單一菌種之間或等于益生菌。這些結(jié)果表明它們之間可能不會發(fā)生交叉喂養(yǎng)。還分析了混合培養(yǎng)物中每個菌種的百分比。結(jié)果顯示，益生菌在混合培養(yǎng)物中的百分比下降，而BO的百分比增加。這與生長曲線的結(jié)果一致。然而， BO作為單一菌種在A23-1上生長良好，而混合培養(yǎng)物則生長不佳。BO和益生菌之間的相互作用機制尚不清楚。
 

圖3 在5 mg/mL A23-1培養(yǎng)基上檢測BO與LR、LGG或BL共培養(yǎng)的生長曲線

4. HGM在A23-1上生長時會產(chǎn)生短鏈脂肪酸
飲食攝入纖維與增強SCFAs的產(chǎn)生有關(guān)，多糖作為纖維之一可以被腸道微生物群利用來產(chǎn)生SCFAs。之前已經(jīng)報道過人類腸道擬桿菌和益生菌可以利用多糖產(chǎn)生SCFAs。檢測了HGM利用A23-1產(chǎn)生SCFAs的情況。擬桿菌主要產(chǎn)生乙酸和丙酸，與BO菌株相比，BC產(chǎn)生乙酸顯著增加(p = 0.0006)，但產(chǎn)生的丁酸和異丁酸較少。分別分析了擬桿菌與益生菌混合培養(yǎng)物產(chǎn)生的SCFAs，并將p值列在柱狀圖上。結(jié)果顯示混合培養(yǎng)物也產(chǎn)生更多的乙酸和丙酸。A23-1對宿主的生物活性是否由SCFAs引起仍是未知的。綜上所述， A23-1可以被HGM代謝產(chǎn)生SCFAs，尤其是乙酸和丙酸。
 

圖5 GC-MS測定短鏈脂肪酸

參考文獻：
Wen C, Li T, Wang B, Jin C, Li S, Li Y, Li M, Ding K. A pectic polysaccharide isolated from Achyranthes bidentata is metabolized by human gut Bacteroides spp. Int J Biol Macromol. 2023 Jul 13;248:125785. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2023.125785IF: 8.2 Q1 . Epub ahead of print. PMID: 37451376IF: 8.2 Q1 .