單細(xì)胞RNA測序的應(yīng)用：SMC4減低誘導(dǎo)類似休眠狀態(tài)結(jié)腸癌細(xì)胞的特性

期刊：Cell Metabolism
影響因子：29
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研究背景
在不利環(huán)境條件下，胚胎發(fā)育可能會可逆地停止，這一過程被稱為滯育。最近有研究表明，腫瘤細(xì)胞可以降低藥物的毒性，通過類滯育的現(xiàn)象，降低腫瘤細(xì)胞的凋亡死亡率。另有報告稱，當(dāng)結(jié)直腸癌（CRC）細(xì)胞受到細(xì)胞毒性藥物治療時，它們會進(jìn)入一種類滯育的狀態(tài)。而這些類滯育的癌細(xì)胞（DLCC）與沒有基因突變的癌干細(xì)胞不同，化療期間復(fù)發(fā)性腫瘤的克隆復(fù)雜性不會消失。然而，關(guān)于癌細(xì)胞向類滯育狀態(tài)（緩慢增殖和對化療耐藥）轉(zhuǎn)變的分子機制以及建立這些細(xì)胞的生物標(biāo)志物譜尚需進(jìn)一步的研究。

研究目的
為了探究DLCCs的基因特征，研究鑒定了各種滯育相關(guān)條件（包括營養(yǎng)剝奪和化療）之間共同變化的基因，并將它們與真正的胚胎滯育基因相結(jié)合。這種方法表明，在滯育轉(zhuǎn)換過程中，結(jié)構(gòu)維持染色體4（SMC4）的下調(diào)是一個常見事件。之前的一項腫瘤學(xué)研究表明SMC4的下調(diào)在基因組不穩(wěn)定性中起作用，表明其下調(diào)是CRC進(jìn)展的驅(qū)動因素。因此，本文使用CRC作為模型系統(tǒng)，旨在揭示SMC4下調(diào)在滯育轉(zhuǎn)換中的功能意義。

研究結(jié)果
1. SMC4被鑒定為CRC中類滯育狀態(tài)的負(fù)調(diào)節(jié)因子
目前已發(fā)表的滯育的研究中，鑒定出的相關(guān)基因數(shù)量相對較多，無法進(jìn)行經(jīng)驗分析，因此本研究假設(shè)進(jìn)一步細(xì)化滯育特征有助于鑒定導(dǎo)致癌細(xì)胞切換到滯育類狀態(tài)的關(guān)鍵基因。由于血清和葡萄糖剝奪是誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞滯育的一種方法，研究者調(diào)查了HCT116人CRC細(xì)胞在去除血清和葡萄糖后引起的轉(zhuǎn)錄組變化。此外，鑒于滯育是一種保守過程的概念，研究者還整合了小鼠滯育胚胎的分析。
 

通過對個別數(shù)據(jù)集與由Rehman等定義的110個“胚胎滯育下調(diào)”特征集進(jìn)行基因集合富集分析(GSEA)，結(jié)果顯示HCT116和小鼠胚胎數(shù)據(jù)集均顯著富集，并且該特征基于的DTP數(shù)據(jù)集也顯著富集。這表明這三個數(shù)據(jù)集中共同變化的基因可能代表了滯育的關(guān)鍵介質(zhì)。

在此基礎(chǔ)上，研究者對這三個數(shù)據(jù)集中差異基因的交集進(jìn)行分析。通過系列實驗，發(fā)現(xiàn)SMC4的下調(diào)是所有實驗系統(tǒng)中唯一一致的變化。因此，該研究的后續(xù)的研究工作重點放在了探討SMC4在癌癥休眠中的作用。

之后，研究者在HCT116細(xì)胞中沉默了SMC4，并評估轉(zhuǎn)錄組的變化。經(jīng)GSEA分析顯示，SMC4敲低顯著富集了胚胎停滯下調(diào)基因的變化。
 

此外，沉默SMC4顯著抑制了HCT116細(xì)胞在2D和3D培養(yǎng)中的增殖。
 

同時，研究者在患者和實驗性結(jié)腸腫瘤組織中觀察到增殖標(biāo)記物Ki67和SMC4的染色之間的定量測量和空間分布的存在相關(guān)性。
 

使用HCT116細(xì)胞的實驗發(fā)現(xiàn)，使用短發(fā)夾RNA（shRNA）沉默SMC4導(dǎo)致伊立替康的IC50值顯著增加，而重新表達(dá)SMC4可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對化療藥物的不敏感。
 

然后，使用HCT116衍生的小鼠異種移植物進(jìn)行了在體研究。然而，考慮到在SMC4沉默后觀察到的對細(xì)胞生長的抑制作用，我們采用了強力霉素誘導(dǎo)的TET-On系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以在腫瘤形成后進(jìn)行敲除。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤形成后10天開始進(jìn)行SMC4敲低會抑制腫瘤的生長。然而，結(jié)合伊立替康治療，SMC4基因敲除的腫瘤生長速度明顯快于對照組腫瘤，表明SMC4基因敲除的腫瘤對化療失去了敏感性。重要的是，去除SMC4基因敲除腫瘤中的強力霉素后，它們對伊立替康的敏感性得以恢復(fù)，這表明與SMC4缺失相關(guān)的生長抑制效應(yīng)是可逆的。
 

2. DLCCs中糖酵解和乳酸的增加促進(jìn)了其對化療的不敏感性
為了探索滯育樣細(xì)胞是否在體內(nèi)發(fā)生，研究者對MC38腫瘤進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）。該測序分析中包含9618個轉(zhuǎn)錄組，對應(yīng)于4種主要細(xì)胞類型，即癌癥細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。SMC4主要在快速循環(huán)的癌癥細(xì)胞中表達(dá)，說明其與增殖相關(guān)。與其他慢循環(huán)細(xì)胞相比，對反應(yīng)缺氧環(huán)境的慢循環(huán)腫瘤細(xì)胞顯示出最低的SMC4表達(dá)。從測序結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞群體具有最高的糖酵解評分和最低的胚胎滯育下降特征評分，這表明低SMC4表達(dá)的DLCCs的的糖酵解反應(yīng)顯著增強。
 

另外，研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)志性的糖酵解途徑在SMC4沉默的HCT116細(xì)胞的GSEA分析中顯著富集。此外，針對所有主要糖酵解酶的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，SMC4沉默與己糖激酶2（HK2）、磷酸果糖激酶、肝臟（PFKL）和醛縮酶C（ALDOC）的表達(dá)增加以及PGAM1的降低有關(guān)，而與其他糖酵解酶類沒有顯著變化。為了進(jìn)一步驗證這些變化足以改變糖酵解通量，研究通過Seahorse XF測量了細(xì)胞外酸化率（ECAR）作為衡量糖酵解通量的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HCT116和RKO結(jié)腸癌癌癥細(xì)胞中SMC4的敲低與糖酵解測量的增強有關(guān)。與這些發(fā)現(xiàn)一致，SMC4沉默后，葡萄糖利用率以及細(xì)胞外和細(xì)胞外乳酸水平增加。乳酸是葡萄糖厭氧分解的產(chǎn)物，也有文獻(xiàn)指出了其在增強癌癥細(xì)胞對化療的不敏感性中的作用。為了驗證SMC4敲低誘導(dǎo)的滯育樣細(xì)胞的藥物不敏感性是否與乳酸產(chǎn)生有關(guān)，用糖酵解抑制劑2-脫氧葡萄糖（2-DG）或乳酸脫氫酶（LDH）抑制劑草酸鈉，處理HCT116細(xì)胞，以阻斷細(xì)胞乳酸產(chǎn)生。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，草酸鹽處理降低了對照組和SMC4沉默細(xì)胞對伊立替康敏感性的差異，而2-DG完全消除了這種差異。
 

因為化學(xué)敏感性的變化在體內(nèi)環(huán)境中最為相關(guān)，所以該研究使用異種移植物模型來驗證這些發(fā)現(xiàn)。與對照組相比，SMC4沉默的腫瘤的生長潛力降低，但對伊立替康的不敏感性明顯增加。此外，盡管單獨用2-DG治療不會影響對照或SMC4沉默的腫瘤的生長，但用2-DG和伊立替康聯(lián)合治療可以逆轉(zhuǎn)SMC4沉默的腫瘤表現(xiàn)出的藥物不敏感性。相反，在伊立替康治療后，SMC4沉默的腫瘤顯示出更高的增殖率，但與2-DG聯(lián)合治療抵消了這一優(yōu)勢。從這些實驗結(jié)果可知，糖酵解的變化和乳酸的增加對SMC4沉默的滯育樣表型具有重要的功能性影響，因此后續(xù)的實驗進(jìn)一步探究了乳酸在其中的作用。
 

3. 組蛋白乳酸化促進(jìn)DLCC中ABC轉(zhuǎn)運蛋白的增加
目前有關(guān)乳酸鹽的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其作為組蛋白中賴氨酸殘基乳酸化的前體的重要意義。由于SMC4沉默細(xì)胞對化療的不敏感性依賴于乳酸鹽，因此，改研究嘗試評估這種表型是否由組蛋白乳酸化的變化引起。首先，研究確認(rèn)了CRC組織中存在具有高糖酵解、低增殖特征的細(xì)胞，其中糖酵解水平是由乳基化賴氨酸殘基的泛特異性抗體（Klac）來衡量的。同時，使用Klac的初步分析顯示，在SMC4沉默后，細(xì)胞裂解物中的乳酸化水平大量增加。靶向組蛋白H3或H4的位點特異性抗體證實了這些變化，觀察到其對H4K8la、H4k12la和H3K14la的反應(yīng)活性增加，其中H4k12a的后一種變化最為顯著。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，研究采用CUT&Tag技術(shù)來分析H4k12la修飾的全基因組變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢測到的峰值分布的顯著變化與SMC4沉默有關(guān)，整個基因組的信號顯著增加，并且集中在轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）附近。
 

此外，GSEA分析顯示，SMC4沉默顯著富集了KEGG“BC轉(zhuǎn)運蛋白途徑”中的基因變化，相關(guān)的ATP驅(qū)動的泵蛋白在調(diào)節(jié)腫瘤藥物流出和治療耐藥性中中起到重要作用。而為了確認(rèn)H4K12la的變化是否是增強特定ABC轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)錄的原因，研究者考慮了ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因的亞群，這些基因在SMC4沉默后表現(xiàn)出不同的H4K12a啟動子峰以及表達(dá)水平的改變。在已鑒定的候選基因中，qPCR分析證實了三個候選基因ABCC2、ABCC3和ABCC10，在SMC4缺失后均顯著增加。同時，使用免疫沉淀（ChIP）法對ABCC2、ABCC3和ABCC10中H4K12la修飾水平的分析同樣證實了，在SMC4沉默后，所有基因啟動子都表現(xiàn)出H4K12a信號的顯著增加。因此，ABCC2、ABCC3和ABCC10中H4k12la修飾的增加與其表達(dá)的增加有關(guān)。而為了證實乳酸和ABC基因調(diào)控之間的因果關(guān)系，后續(xù)的研究對乳酸水平進(jìn)行了人為的增加或降低。實驗表明，用外源性乳酸鹽或丙二醇酮處理細(xì)胞提高了乳酸鹽水平，會顯著增加了ABCC2、ABCC3和ABCC10的表達(dá)，而使用2-DG或草酸鈉抑制細(xì)胞內(nèi)乳酸鹽的產(chǎn)生則會降低了它們的表達(dá)。綜上所述，高乳酸水平有助于驅(qū)動ABC基因表達(dá)。最后，鑒于ABC轉(zhuǎn)運蛋白與癌癥細(xì)胞對化療的敏感性之間存在密切關(guān)系，該研究又通過，加入ABCC2抑制劑丙酸，成功逆轉(zhuǎn)了SMC4沉默細(xì)胞對伊立替康的不敏感性，證實了藥物流出有助于類滯育CRC細(xì)胞的耐藥性。
 

4.DLCCs中的細(xì)胞分裂失敗和多倍體是通過減少F-肌動蛋白組裝引起的
在SMC4敲低誘導(dǎo)的DLCCs中，隨著細(xì)胞大小和多倍體細(xì)胞存在的增加，也會產(chǎn)生表型上變化。這些變化在HCT116細(xì)胞的圖像中不太明顯，但在RKO和MC38細(xì)胞中很明顯。與沒有多倍體的區(qū)域相比，CRC組織中的多倍體細(xì)胞群體似乎也表現(xiàn)出較低的SMC4表達(dá)水平。由于多倍體通常是由胞質(zhì)分裂失敗引起的，研究又對SMC4沉默是如何影響這一過程的進(jìn)行了探索。為了確認(rèn)SMC4是否影響收縮環(huán)的形成，研究者對分裂細(xì)胞中F-肌動蛋白和肌球蛋白II分布進(jìn)行了觀測，發(fā)現(xiàn)SMC4沉默的細(xì)胞，收縮環(huán)形成失敗，染色區(qū)域集中在分裂細(xì)胞核附近，但不在分裂細(xì)胞核之間聚集。使用檢測活細(xì)胞中F-肌動蛋白的lifeact探針進(jìn)行的替代分析表明，SMC4沉默的細(xì)胞未能進(jìn)行胞質(zhì)分裂，這與F-肌動蛋白的異常分布有關(guān)。
 

已有研究指出，PGAM1通過與α-肌動蛋白2（ACTA2）結(jié)合以增加F/G-肌動蛋白比率，在促進(jìn)F-肌動蛋白組裝中發(fā)揮非酶促作用。而該研究發(fā)現(xiàn)，PGAM1的過表達(dá)可以促進(jìn)對照細(xì)胞中F/G-肌動蛋白比率的顯著增加，并且與SMC4沉默相結(jié)合，可以在很大程度上逆轉(zhuǎn)F/G-肌動蛋白比例的降低以及多倍體的增加。同時，該研究也證實了異位表達(dá)的PGAM1可以部分補償SMC4沉默引起的細(xì)胞增殖能力下降。這些結(jié)果表明，伴隨SMC4敲低而來的PGAM1表達(dá)降低，通過其對胞質(zhì)分裂的非酶作用，有助于產(chǎn)生類滯育表型。
 

5. 抑制SMC4會增強原位小鼠模型對化療的不敏感性
接著，本研究又從胚胎發(fā)生和腫瘤發(fā)生的雙重角度來探究SMC4在體內(nèi)的意義及其與細(xì)胞滯育的關(guān)系。首先，研究者利用CRISPR-Cas9技術(shù)破壞了小鼠中的SMC4轉(zhuǎn)錄本，并猜想SMC4的大規(guī)模缺失可能導(dǎo)致胚胎死亡。而后續(xù)結(jié)果驗證了此猜想，Smc4+/-雜合小鼠之間的交配未能產(chǎn)生Smc4-/-純合小鼠，而且雜合小鼠的產(chǎn)生頻率也低于預(yù)期的Men-delian頻率。這表明SMC4缺失存在一定程度的單倍充足性，但確切原因尚不清楚。然后，本研究還測試了SMC4在主要器官中的表達(dá)水平，包括結(jié)腸、脾臟和肝臟。實驗發(fā)現(xiàn)，SMC4在SMC4+/-小鼠的器官中的表達(dá)較低。然而，對有活力的Smc4+/-小鼠的體重跟蹤顯示，與野生型同窩出生的對照組相比，沒有差異。此外，雜合小鼠沒有表現(xiàn)出明顯的異常，例如，Smc4+/-小鼠和野生型同窩小鼠的結(jié)腸長度沒有顯著變化。
 

然后，研究者將這些小鼠與偶氮乙烷（AOM）/右旋糖酐硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的CRC模型相結(jié)合，試圖發(fā)掘SMC4表達(dá)對腫瘤發(fā)生和化療反應(yīng)的影響。結(jié)果在腫瘤發(fā)生中觀察到了顯著的變化，其中Smc4+/-小鼠的遠(yuǎn)端結(jié)腸腫瘤的數(shù)量和大小顯著少于野生型同窩出生的小鼠，并且Smc4+/-腫瘤組織含有明顯較少比例的有絲分裂癌癥細(xì)胞。然后，該研究又進(jìn)一步揭露了SMC4的減少是如何影響伊立替康作用的。研究發(fā)現(xiàn)，伊立替康的治療顯著抑制了腫瘤的發(fā)生，但Smc4+/-腫瘤組織的生長速度明顯快于野生型同窩出生的腫瘤，這表明Smc4+/-腫瘤對化療的敏感性降低。Smc4+/-和Smc4+/+腫瘤中糖酵解酶表達(dá)的比較顯示，與細(xì)胞系實驗中觀察到的變化一致，腫瘤組織中的HK2和PFKL增加，PGAM1水平降低。
 

研究總結(jié)
本文揭示了SMC4在結(jié)直腸癌細(xì)胞向類滯育狀態(tài)切換過程中的多種作用。SMC4減弱可促進(jìn)糖酵解酶的表達(dá)，增加乳酸的產(chǎn)生，同時抑制PGAM1。由此產(chǎn)生的高乳酸水平通過組蛋白乳糖基化增加ABC轉(zhuǎn)運體的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療不敏感。SMC4是PGAM1轉(zhuǎn)錄的協(xié)同激活劑，而SMC4和PGAM1的協(xié)同缺失會影響F-actin組裝，導(dǎo)致有絲分裂失敗和多倍體形成，從而抑制細(xì)胞增殖。這些對非遺傳化療耐藥機制的洞察可能對該領(lǐng)域具有重要意義，增進(jìn)我們對腫瘤中需氧糖酵解功能的理解，并可能為未來的治療策略提供參考。

原文鏈接
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1550-4131(23)00264-4