小鼠模型在發(fā)現(xiàn)調(diào)控NAFLD疾病進(jìn)程的新型蛋白CAND1研究中的應(yīng)用

非酒精性脂肪肝�。∟AFLD）包含一系列疾病，非酒精性脂肪性肝（NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH），甚至最后發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌。NAFLD患者肝臟最常見(jiàn)的病理特征是肝細(xì)胞脂肪變性、胰島素抵抗、炎癥甚至纖維化。盡管在探索NAFLD的新分子機(jī)制和治療靶點(diǎn)方面投入越來(lái)越多，但由于缺乏有效的治療藥物，NAFLD的治療仍然存在重大挑戰(zhàn)和困難。

Cullin-RING連接酶（CRLs）是大約250種酶復(fù)合物的集合，這些酶復(fù)合物使蛋白質(zhì)底物泛素化以改變其功能或標(biāo)記其蛋白酶體降解。在NAFLD的發(fā)展過(guò)程中，許多蛋白的穩(wěn)態(tài)被擾亂，干預(yù)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)微調(diào)靶蛋白的表達(dá)已成為NAFLD潛在的治療策略。

2023年8月1日，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)潘振偉團(tuán)隊(duì)在《Nature Communications》發(fā)表題為“Cullin-associated and neddylation-dissociated protein 1 (CAND1) alleviates NAFLD by reducing ubiquitinated degradation of ACAA2”的研究論文，該研究發(fā)現(xiàn)CAND1在NAFLD患者，高脂喂養(yǎng)小鼠和PA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中蛋白和mRNA水平顯著降低，并且CAND1抑制Cullin1，F(xiàn)BXO42和ACAA2復(fù)合物組裝進(jìn)而阻止ACAA2的泛素化降解，減緩NAFLD疾病進(jìn)程，AR作為CAND1的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)CAND1的表達(dá)。AR-CAND1-ACAA2信號(hào)軸為揭示NAFLD的發(fā)病機(jī)制提供了新的方向，對(duì)于今后的藥物治療具有重要的臨床意義。
 

圖片來(lái)源：《Nature Communications》（https://doi.org/10.1038/s41467-023-40327-5）

研究材料
在這項(xiàng)研究中，研究人員使用CAND1^flox/flox和CAND1^knockin小鼠分別與Alb-cre工具鼠雜交得到了肝臟特異性敲除和過(guò)表達(dá)的小鼠，小鼠都由賽業(yè)公司提供。此外研究人員還使用了NAFLD人群樣本檢測(cè)。

研究方法
作者采用了多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，包括各種組織學(xué)染色、WB、qPCR、蛋白質(zhì)組學(xué)測(cè)序、蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）和熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等。

技術(shù)路線
01 GEO數(shù)據(jù)庫(kù)篩出候選基因CAND1
02 構(gòu)建CAND1基因敲除和過(guò)表達(dá)小鼠模型驗(yàn)證其功能
03 CAND1調(diào)節(jié)NAFLD的機(jī)制探究
04 調(diào)控CAND1表達(dá)水平的機(jī)制研究

研究結(jié)果

圖1 CAND1在NAFLD患者，HFD小鼠和PA誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中低表達(dá)[^[1]

研究人員在NAFLD患者和正常供者的肝活檢樣本中檢測(cè)了CAND1的表達(dá)水平。與正常供體相比，NAFLD患者肝臟組織中CAND1 mRNA和蛋白質(zhì)含量降低。與對(duì)照組相比，HFD喂養(yǎng)后小鼠肝臟中CAND1 mRNA和蛋白質(zhì)水平也顯著降低。此外，AML12和THLE-2細(xì)胞暴露于棕櫚酸（PA）24小時(shí)后，CAND1 mRNA和蛋白質(zhì)水平也顯著降低，這些結(jié)果表明，CAND1在NAFLD的發(fā)展中起著合理的作用，如圖1所示。
 

圖2 肝細(xì)胞特異性CAND1缺乏加劇了雄性小鼠hfd誘導(dǎo)的肝損傷^[1]

為了驗(yàn)證CAND1對(duì)肝細(xì)胞的特異性作用，研究人員使用賽業(yè)生物提供的CAND1^flox/flox小鼠與Alb-cre工具鼠雜交構(gòu)建了肝細(xì)胞特異性CAND1敲除（條件敲除，cKO）雄性小鼠。值得注意的是，在HFD治療后，WT和CAND1 cKO小鼠的食物攝入量沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HFD處理增加了16周后WT和CAND1 cKO小鼠的體重和附睪脂肪重量，WT-HFD和CAND1 cKO-HFD小鼠的體重和附睪脂肪重量相當(dāng)。CAND1 cKO-HFD小鼠的LB/BW比增加。與WT-HFD小鼠相比，CAND1 cKO-HFD小鼠的TG和TC水平顯著升高。H&E和油紅O染色顯示，CAND1 cKO-HFD小鼠肝臟中的脂質(zhì)積累比WT-HFD小鼠更嚴(yán)重。CNAD1 cKO-HFD小鼠表現(xiàn)出更高的空腹血糖、胰島素濃度和HOMA-IR。此外，與WT-HFD小鼠相比，CAND1 cKO-HFD小鼠表現(xiàn)出更強(qiáng)的葡萄糖耐量和胰島素敏感性。肝臟炎癥是NAFL發(fā)展為NASH的常見(jiàn)病理改變。與WT-HFD小鼠相比，CAND1 cKO-HFD小鼠肝臟中促炎因子的表達(dá)增加。然而，WT-HFD和CAND1 cKO-HFD小鼠的纖維化面積和血清αFP（肝癌標(biāo)志物）水平?jīng)]有差異。這些發(fā)現(xiàn)表明肝細(xì)胞中CAND1缺乏加重了hfd誘導(dǎo)的肝損傷，如圖2所示。
 

圖3 肝細(xì)胞特異性CAND1過(guò)表達(dá)改善雄性小鼠hfd誘導(dǎo)的肝損傷^[1]

研究人員進(jìn)一步使用賽業(yè)生物提供的CAND1^knockin小鼠與Alb-cre工具鼠雜交建立了肝細(xì)胞特異性CAND1過(guò)表達(dá)（條件敲入，cKI）雄性小鼠系，以驗(yàn)證肝細(xì)胞CAND1對(duì)HFD治療后肝損傷的功能。HFD或NC治療后，WT與CAND1 cKI小鼠的進(jìn)食量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HFD治療在HFD治療16周后增加了WT和CAND1 cKI雄性小鼠的體重和附睪脂肪重量，WT-HFD和cKI-HFD小鼠的體重和附睪脂肪重量相當(dāng)。與CAND1 cKO小鼠的變化相反，肝細(xì)胞特異性過(guò)表達(dá)CAND1在很大程度上保護(hù)了HFD誘導(dǎo)的肝脂肪變性、肝抵抗和炎癥。具體而言，肝細(xì)胞中CAND1的過(guò)表達(dá)改善了肝脂肪變性，降低了LW/BW比和肝臟中TG和TC的含量。與WT-HFD小鼠相比，CAND1 cKI-HFD小鼠的糖耐量和胰島素敏感性顯著提高。此外，CAND1 cKI-HFD小鼠的促炎因子mRNA水平低于WT-HFD小鼠。天狼星紅染色顯示W(wǎng)T-HFD和cKI-HFD雄性小鼠的纖維化面積沒(méi)有差異。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了CAND1在hfd誘導(dǎo)的肝損傷中的保護(hù)作用，如圖3所示。
 

圖4 CAND1控制脂肪酸β-氧化基因ACAA2的泛素化降解^[1]
 

圖5 CAND1抑制Cullin1、FBXO42和ACAA2復(fù)合物的形成^[1]

CAND1通過(guò)調(diào)節(jié)含有底物受體的F-box和Cullin1復(fù)合物的組裝來(lái)控制全局CRLs網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)力學(xué)。為了闡明CAND1調(diào)控NAFLD發(fā)展的機(jī)制，研究人員進(jìn)行了Co-IP和質(zhì)譜分析，以鑒定轉(zhuǎn)染NC或siCAND1的PA處理的L02細(xì)胞中的cullin1結(jié)合蛋白。共獲得72個(gè)解除調(diào)控的cullin1結(jié)合蛋白，其中39個(gè)基因上調(diào)，33個(gè)基因下調(diào)。在上調(diào)基因中，乙酰輔酶A�；�轉(zhuǎn)移酶2（ACAA2）和F-box蛋白42（FBXO42）引起了研究人員的注意。ACAA2是一種脂肪酸β氧化的硫解酶，其過(guò)表達(dá)可促進(jìn)脂肪酸氧化并抑制脂質(zhì)積累。F-box蛋白FBXO42是一種底物受體，可招募靶蛋白并促進(jìn)其泛素化降解。他們推測(cè)Cullin1、FBXO42和ACAA2可能形成一個(gè)SCF復(fù)合物，調(diào)節(jié)ACAA2的泛素化和降解，從而影響CAND1對(duì)NAFLD的作用。分子對(duì)接也預(yù)測(cè)了FBXO42與ACAA2和Cullin1結(jié)合。

研究人員檢測(cè)了Cullin1、FBXO42和ACAA2復(fù)合物在AML12和THLE-2細(xì)胞中的形成。PA處理后siCAND1中ACAA2、Cullin1和FBXO42復(fù)合物的形成較NC組明顯增加，PA處理后siCAND1中ACAA2蛋白表達(dá)較NC組明顯下調(diào)。

與WT小鼠相比，WT-hfd小鼠的ACAA2蛋白表達(dá)明顯降低。與WT-hfd小鼠相比，CAND1 cKO-HFD小鼠的ACAA2蛋白顯著降低，表明ACAA2泛素化程度較高。CAND1 cKI-HFD雄性小鼠的ACAA2蛋白顯著上調(diào)，泛素化水平明顯降低。

接下來(lái)，研究人員用Co-IP法檢測(cè)Cullin1、FBXO42和ACAA2復(fù)合物。與WT小鼠相比，WT-hfd小鼠中ACAA2、Cullin1和FBXO42復(fù)合物的形成明顯增加，且CAND1 cKO-HFD中ACAA2、Cullin1和FBXO42復(fù)合物的含量高于WT-hfd小鼠。然而，與WT-HFD小鼠相比，CAND1 cKI-HFD小鼠中ACAA2、Cullin1和FBXO42復(fù)合物的含量較少。這些結(jié)果表明，CAND1抑制ACAA2、Cullin1和FBXO42復(fù)合物的組裝，從而抑制ACAA2的泛素化降解，如圖4，5所示。
 

圖6 ACAA2過(guò)表達(dá)可改善因CAND1缺陷增強(qiáng)的雄性小鼠肝脂肪變性、胰島素抵抗和炎癥^[1]

為了進(jìn)一步闡明CAND1對(duì)NAFLD的調(diào)節(jié)作用是否由ACAA2介導(dǎo)，研究人員通過(guò)尾靜脈向雄性小鼠注射AAV8-ACAA2病毒，特異性提高了ACAA2在肝細(xì)胞中的表達(dá)。ACAA2過(guò)表達(dá)大大改善了CAND1 cKO-HFD小鼠的病理改變，包括LB/BW比、肝臟TG和TC水平以及脂質(zhì)積累。此外，ACAA2過(guò)表達(dá)顯著消除了CAND1條件敲除對(duì)飼喂HFD小鼠的空腹血糖、空腹胰島素和HOMA-IR指數(shù)的加重作用。此外，ACAA2過(guò)表達(dá)改善了CAND1 cKO-HFD小鼠的葡萄糖耐量和胰島素敏感性，這一點(diǎn)通過(guò)腹腔注射GTT和ITT得到了證明。ACAA2過(guò)表達(dá)也降低了CAND1 cKO-HFD小鼠中促炎因子IL-6、TNF-α和TLR-4的水平。這些結(jié)果表明，肝細(xì)胞CAND1對(duì)NAFLD進(jìn)展的影響是由ACAA2介導(dǎo)的，如圖6所示。
 

圖7 肝細(xì)胞特異性CAND1敲除促進(jìn)雄性小鼠饑餓誘導(dǎo)的脂肪肝^[1]

在禁食條件下，過(guò)量的脂肪酸被重新酯化成甘油三酯，在肝臟細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存，從而導(dǎo)致饑餓性脂肪肝。然后，研究人員探討了CAND1是否也對(duì)饑餓誘導(dǎo)的脂肪肝有調(diào)節(jié)作用。在雄性小鼠饑餓24h后，他們檢測(cè)了肝臟脂質(zhì)的積累。結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，CAND1 cKO雄性小鼠饑餓后肝臟脂質(zhì)積累更為嚴(yán)重。CAND1 cKO雄性小鼠肝臟中TG和TC水平也顯著升高。此外，CAND1 cKO中ACAA2水平顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明，CAND1也抑制饑餓誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)代謝，如圖7所示。
 

圖8 雄激素/雄激素受體（AR）信號(hào)調(diào)控CAND1的轉(zhuǎn)錄^[1]

由于NAFLD肝臟中CAND1的mRNA水平降低，他們隨后探索了CAND1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。研究人員使用JASPAR網(wǎng)站預(yù)測(cè)了CAND1基因的轉(zhuǎn)錄因子，并在CAND1基因的啟動(dòng)子區(qū)域確定了四個(gè)雄激素受體（AR）的潛在結(jié)合位點(diǎn)。他們觀察到NAFLD雄性小鼠與正常鼠相比睪酮和AR水平下降。PA誘導(dǎo)后AML12細(xì)胞中AR表達(dá)也下降。有趣的是，與WT雄性小鼠相比，CAND1 cKO雄性小鼠的AR表達(dá)和睪酮水平顯著降低。

為了闡明AR對(duì)CAND1轉(zhuǎn)錄的直接影響，研究人員將AR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和含有順序截?cái)嗟腃AND1啟動(dòng)子的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。在CAND1啟動(dòng)子區(qū)域鑒定了四個(gè)推測(cè)的AR結(jié)合位點(diǎn)。這些結(jié)合位點(diǎn)的序列缺失表明，ar結(jié)合位點(diǎn)1是ar促進(jìn)CAND1轉(zhuǎn)錄活性的主要位點(diǎn)。此外，睪酮處理上調(diào)了AML12細(xì)胞中CAND1的mRNA和蛋白水平。pa誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累在siCAND1組和siAR組相似。在AML12細(xì)胞中，與單獨(dú)敲低CAND1相比，AR和CAND1的同時(shí)敲低加重了PA誘導(dǎo)的脂質(zhì)積累，而在PA處理后，CAND1的過(guò)表達(dá)減輕了AR缺陷引起的AML12細(xì)胞中的脂質(zhì)積累。研究人員給雄性小鼠服用AR拮抗劑enzalutamide（10mg/kg），發(fā)現(xiàn)CAND1 mRNA和蛋白水平顯著降低。并且，小鼠出生后2-6個(gè)月肝臟中CAND1水平升高，12個(gè)月時(shí)下降，這與AR的表達(dá)變化一致。這些結(jié)果表明，CAND1的轉(zhuǎn)錄受雄激素受體的調(diào)節(jié)，如圖8所示。

研究結(jié)論

圖9 CAND1在調(diào)節(jié)ACAA2泛素化和降解中的作用^[1]

在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)CAND1阻斷Cullin1、FBXO42和ACAA2復(fù)合物的組裝，抑制ACAA2的泛素化降解，從而維持肝細(xì)胞內(nèi)脂肪酸降解的速度，減少肝臟內(nèi)脂質(zhì)積累。雄激素受體通過(guò)結(jié)合-187到-2000啟動(dòng)子區(qū)域來(lái)決定CAND1的轉(zhuǎn)錄。研究結(jié)果表明，CAND1是治療NAFLD的一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。

原文檢索：
[1] Xiang Huang, Xin Liu, Xingda Li, Yang Zhang, Jianjun Gao, Ying Yang 1, Yuan Jiang, Haiyu Gao, Chongsong Sun, Lina Xuan, Lexin Zhao, Jiahui Song, Hairong Bao, Zhiwen Zhou, Shangxuan Li, Xiaofang Zhang, Yanjie Lu, Xiangyu Zhong, Baofeng Yang, Zhenwei Pan. Cullin-associated and neddylation-dissociated protein 1 (CAND1) alleviates NAFLD by reducing ubiquitinated degradation of ACAA2. Nature Communications, 2023 Aug 1;14(1):4620. doi: 10.1038/s41467-023-40327-5.