Agrp-IRES-CreERT2-P2A-tdTomato小鼠的構(gòu)建及應(yīng)用介紹

肥胖和饑餓是兩個密切相關(guān)的生理狀態(tài)，涉及復(fù)雜的神經(jīng)和激素調(diào)控機(jī)制。在研究這些代謝機(jī)制時，對饑餓信號敏感的NPY/AgRP神經(jīng)元扮演了重要角色。今天，小賽要為大家介紹靶向下丘腦弓狀核的Agrp-IRES-CreERT2-P2A-tdTomato小鼠（產(chǎn)品編號：C001558）。

NPY/AgRP神經(jīng)元
大腦中的NPY/AgRP神經(jīng)元僅存在于下丘腦弓狀核（ARC），在饑餓狀態(tài)下高度活躍。這些神經(jīng)元不僅通過增加神經(jīng)肽Y（NPY）信號傳導(dǎo)，還通過釋放AgRP來抑制黑皮質(zhì)素信號傳導(dǎo)，從而制造肽類物質(zhì)，有效促進(jìn)食欲^[1]。AGRP基因編碼的刺鼠肽基因相關(guān)蛋白（Agouti-related protein, AgRP）是一種由NPY/AgRP神經(jīng)元在大腦中產(chǎn)生的神經(jīng)肽，主要在下丘腦弓狀核、腎和腎上腺中表達(dá)。AgRP僅在下丘腦弓狀核腹側(cè)部分的含有神經(jīng)肽Y（NPY）的細(xì)胞體中合成，并與NPY共表達(dá)，起到增加食欲、減少新陳代謝和減少能量消耗的作用，是最有效和持久的食欲刺激劑之一。
 

圖1 NPY/AgRP神經(jīng)元位于下丘腦弓狀核內(nèi)^[2]

賽業(yè)生物利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建了Agrp-IRES-CreERT2-P2A-tdTomato小鼠（產(chǎn)品編號：C001558），在小鼠內(nèi)源性Agrp基因調(diào)控元件驅(qū)動下，該小鼠表達(dá)他莫昔芬誘導(dǎo)型CreERT2重組酶。此外，該品系的CreERT2重組酶表達(dá)元件后攜帶了一個紅色熒光蛋白（tdTomato）表達(dá)元件，可用于Agrp陽性細(xì)胞的譜系追蹤。在未經(jīng)他莫昔芬處理時，CreERT2重組酶只存在于細(xì)胞質(zhì)中。經(jīng)他莫昔芬處理后，CreERT2重組酶才能進(jìn)入細(xì)胞核并發(fā)揮其重組作用。當(dāng)Agrp-IRES-CreERT2-P2A-tdTomato小鼠與含有l(wèi)oxP位點(diǎn)的小鼠雜交后，經(jīng)他莫昔芬誘導(dǎo)可以在子代小鼠的AgRP陽性神經(jīng)元中引發(fā)由Cre重組酶介導(dǎo)的loxP位點(diǎn)間的序列重組。

在下丘腦中成功介導(dǎo)Zsgreen熒光蛋白表達(dá)

圖2 下丘腦中Cre重組酶的表達(dá)情況

將Agrp-IRES-CreERT2-P2A-tdTomato小鼠與條件性表達(dá)Zsgreen熒光蛋白的LSL_Zsgreen小鼠交配，他莫昔芬（Tamoxifen）誘導(dǎo)完成后，采集子代小鼠的下丘腦組織并通過冰凍切片檢測組織中Zsgreen蛋白的自發(fā)熒光情況。結(jié)果顯示，在他莫昔芬處理后，Agrp-IRES-CreERT2-P2A-tdTomato; LSL_Zsgreen雙陽性小鼠下丘腦中存在自發(fā)綠色熒光信號且信號特異性存在于下丘腦弓狀核（ARC）區(qū)域。

tdTomato熒光蛋白與Zsgreen熒光蛋白表達(dá)共定位

圖3 下丘腦中Zsgreen綠色熒光蛋白表達(dá)與tdTomato紅色熒光蛋白表達(dá)的共定位情況

通過tdTomato蛋白表達(dá)的免疫熒光染色（IF）檢測，確定該模型中tdTomato蛋白標(biāo)記的細(xì)胞類型。結(jié)果顯示，Agrp-IRES-CreERT2-P2A-tdTomato; LSL_Zsgreen雙陽性小鼠在他莫昔芬處理后的下丘腦中可同時檢測到tdTomato紅色熒光蛋白和Zsgreen綠色熒光蛋白信號，且Cre重組酶誘導(dǎo)的Zsgreen綠色熒光信號與小鼠內(nèi)源性Agrp調(diào)控的tdTomato熒光信號共定位，表明在該模型中Cre重組酶的表達(dá)模式與小鼠內(nèi)源性Agrp相同。

總  結(jié)
在Agrp-IRES-CreERT2-P2A-tdTomato小鼠（產(chǎn)品編號：C001558）模型中，Cre重組酶的表達(dá)主要集中于下丘腦弓狀核（ARC）區(qū)域。

本文摘自：https://www.cyagen.cn/articles/AE000705