mRNA檢測(cè)應(yīng)用探究ACTL6A通過誘導(dǎo)GSH合成抑制胃癌細(xì)胞鐵死亡

 

期刊：Nature Communications
影響因子：16.6
伯豪技術(shù)服務(wù)：mRNA檢測(cè)

導(dǎo)讀
胃癌（GC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其轉(zhuǎn)移速度快，死亡率高。迫切需要GC的診斷標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。究發(fā)現(xiàn)ACTL6A對(duì)于調(diào)節(jié)谷胱甘肽 (GSH) 代謝途徑至關(guān)重要,它上調(diào)γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基 (GCLC) 的表達(dá)，從而降低活性氧 (ROS) 水平并抑制鐵死亡。機(jī)制研究表明，ACTL6A作為核因子(紅細(xì)胞衍生2)樣2 (NRF2)的共轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)GCLC，且ACTL6A的疏水區(qū)起重要作用。本研究數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了 ACTL6A 在 GC 中的致癌作用，并表明抑制 ACTL6A 或 GCLC 可能是 GC 的潛在治療策略。

研究技術(shù)
mRNA microarray、LC-MS、CHIP-seq

研究設(shè)計(jì)圖

2. ACTL6A通過重編程GSH代謝以促進(jìn)胃癌惡性進(jìn)展
ACTL6A-KD SNU638細(xì)胞mRNA芯片結(jié)果表明ACTL6A的表達(dá)與信號(hào)通路之間的關(guān)聯(lián)，其中GSH代謝是相關(guān)性最高的途徑之一(Fig 2a)，GC 數(shù)據(jù)集 GSE15459 和 GSE27342也有相同的結(jié)論(Fig 2b-c)。GSH通過GSH/GSSG循環(huán)保護(hù)癌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，降低細(xì)胞內(nèi) ROS 水平并將 NADPH 轉(zhuǎn)化為 NADP+（Fig 2d），并用ACTL6A-KD細(xì)胞驗(yàn)證了這一結(jié)果(Fig 2e-f)。DCFH-DA 結(jié)果表明，ACTL6A-KD細(xì)胞是否經(jīng)過H2O2 處理都有較高的ROS 水平（Fig 2g）。此外，作者還發(fā)現(xiàn)N-乙酰半胱氨酸（NAC），可以重建ACTL6A-KD細(xì)胞增殖（Fig 2h-i）。NAC治療恢復(fù)了ACTL6A-KD PDO的囊狀結(jié)構(gòu)（Fig 2j）。GC異種移植小鼠結(jié)果表明，ACTL6A-KD顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，NAC治療又顯著逆轉(zhuǎn)了這種效應(yīng)（Fig 2k-n）。
 

3. ACTL6A 抑制 GC 細(xì)胞鐵死亡
為了確定 ACTL6A 是否抑制 GC 細(xì)胞的鐵死亡，作者在ACTL6A消融的細(xì)胞中通過鐵死亡抑制(Fer-1)處理，細(xì)胞活力顯著恢復(fù)（Fig 3a），還觀察到ACTL6A敲低使GC細(xì)胞對(duì)H2O2、erastin和BSO敏感（Fig 3b-f）。鐵死亡的一個(gè)標(biāo)志是脂質(zhì)過氧化物的積累，作者對(duì)ACTL6A-KD的細(xì)胞進(jìn)行了C11-BODIPY染色，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)過氧化水平升高，并且在用erastin處理的細(xì)胞中這種表型更加明顯，并且可以通過Fer-1處理來(lái)改變（Fig 3g），此外，F(xiàn)er-1處理緩解了ACTL6A-KD誘導(dǎo)的PDO生長(zhǎng)抑制，并使類器官恢復(fù)囊狀結(jié)構(gòu)（Fig 3h）。通過對(duì)異種移植腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué) (IHC) 染色，發(fā)現(xiàn) ACTL6A-KD會(huì)顯著降低增殖標(biāo)記物 Ki67 的水平，并增加增殖標(biāo)記物 4-HNE的水平（Fig 3i）。
 

4. ACTL6A 通過上調(diào) γ-谷氨酰-半胱氨酸合成來(lái)影響 GSH 從頭合成
通過LC-MS評(píng)估ACTL6A調(diào)節(jié)GSH代謝的機(jī)制，研究C13-glucose的代謝去向(Fig 4a)。但是，結(jié)果未觀察到C13-glucose對(duì)谷氨酸、絲氨酸或甘氨酸的總貢獻(xiàn)發(fā)生顯著變化（Fig 4b-d）。同位素實(shí)驗(yàn)表明，GSH的水平在表達(dá) ACTL6A-KD的細(xì)胞中減少（Fig 4e-f）。此外，作者還研究了C13-glutamine的代謝去向，它是通過GSH從頭合成產(chǎn)生含有5個(gè)13C原子的γ-GC和GSH（Fig 4g）, C13-glutamine對(duì)谷氨酸鹽總貢獻(xiàn)未發(fā)生顯著變化（Fig 4h）。同位素實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這結(jié)論（Fig 4i-j）。
 

5. ACTL6A在調(diào)控GCLC
ACTL6A-KD抑制了異種移植組織中GCLC的表達(dá)(Fig 5a)，敲降后過表達(dá)GCLC，逆轉(zhuǎn)了對(duì)細(xì)胞增殖的抑制(Fig 5b)。DCFH-DA染色檢測(cè)，GCLC過表達(dá)恢復(fù)了敲降A(chǔ)CTL6A的細(xì)胞的ROS水平，并被NAC逆轉(zhuǎn)(Fig 5c)。C11-BODIPY染色表明，GCLC過表達(dá)恢復(fù)了細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化水平，在Erastin處理時(shí)表型仍然顯著，而Fer-1逆轉(zhuǎn)（Fig 5d)。
 

6. ACTL6A通過NRF2在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控GCLC
為了探索ACTL6A如何調(diào)控GCLC，作者通過對(duì)GC細(xì)胞中內(nèi)源性ACTL6A進(jìn)行CHIP-SEQ分析，在GCLC的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)附近有一個(gè)顯著的峰(Fig 6a)。Chip-seq結(jié)果表明，在GCLC的TSS附近的峰中，有一個(gè)序列與NRF2結(jié)合基序高度同源(Fig 6b)，作者推測(cè)ACTL6A可能與NRF2協(xié)同作用來(lái)調(diào)節(jié)GCLC的表達(dá)。熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了NRF2和GCLC的相關(guān)性。用CHIP和qRT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)ACTL6A和NRF2都與GCLC TSS附近的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)相互作用(Fig 6d-e)。
 

7. ACTL6A 的 HR 結(jié)構(gòu)域?qū)τ谡{(diào)節(jié) GCLC 和鐵死亡至關(guān)重要
構(gòu)建四種缺失突變體并轉(zhuǎn)染至ACTL6A-KD細(xì)胞中（Fig 7a）,發(fā)現(xiàn)野生型（WT）ACTL6A和ΔDNBL、ΔCC和ΔNBC ACTL6A突變體逆轉(zhuǎn)了敲低ACTL6A表達(dá)引起的細(xì)胞增殖抑制和GCLC蛋白表達(dá)減少，但ACTL6A HR缺失突變體沒有表現(xiàn)出這一點(diǎn)恢復(fù)效果（Fig 7b-c），增加ACTL6A ΔHR缺失突變體的劑量未能逆轉(zhuǎn)GCLC mRNA表達(dá)的減少（Fig 7d）。緊接著，進(jìn)行了co-IP，發(fā)現(xiàn)ACTL6A ΔHR突變體不與NRF2結(jié)合（Fig 7e）。CHIP測(cè)定表明，與 （WT） ACTL6A 相比，ACTL6A ΔHR缺失突變體對(duì) NRF2 與 GCLC 啟動(dòng)子的結(jié)合沒有表現(xiàn)出恢復(fù)作用（Fig 7f ）。之后進(jìn)行DCFH-DA 和 C11-BODIPY 染色實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)（WT） ACTL6A 逆轉(zhuǎn)了 ROS 水平和脂質(zhì)過氧化水平的增加，相反，ACTL6A ΔHR缺失突變體并沒有逆轉(zhuǎn)這些高水平（Fig 7g-h）。
 

8. ACTL6A-GCLC-GSH 代謝軸與 GC 細(xì)胞鐵死亡的臨床相關(guān)性
為了確定 ACTL6A 在患者來(lái)源的PDX模型中調(diào)節(jié) GCLC 和抑制鐵死亡的臨床相關(guān)性，對(duì)ACTL6A 進(jìn)行免疫印記分析（Fig 8a），進(jìn)行異種移植，然后注射GCLC抑制劑BSO給小鼠（Fig 8b）。BSO可以減弱腫瘤進(jìn)展，相反，GCLC抑制對(duì)ACTL6A表達(dá)低的PDX腫瘤的生長(zhǎng)影響最�。‵ig 8c-f）。PDX腫瘤冰凍切片進(jìn)行DCFH-DA和C11-BODIPY染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ACTL6A高表達(dá)的PDX腫瘤的ROS水平和脂質(zhì)過氧化水平較低，而BSO處理后則顯著升高（Fig 8g-j）。通過LC-MS研究N15-glutamine在體內(nèi)的代謝命運(yùn)，它通過GSH從頭合成產(chǎn)生含有一個(gè)N15原子的GSH肽（Fig 8k），并對(duì)高表達(dá)ACTL6A的PDX腫瘤施用BSO降低了總GSH水平（Fig 8l）,N15-glutamine對(duì)GSH的總貢獻(xiàn)減少（Fig 8m），BSO處理降低了GSH/Gln的比率（Fig 8n）。Kaplan-Meier分析表明，高 ACTL6A 和 GCLC 水平與較差的總體生存率相關(guān)（Fig 8o）。值得注意的是，GCLC 表達(dá)與 GC 中的 ACTL6A 顯著正相關(guān)（Fig 8p )。
 

參考文獻(xiàn):
Yang Z, Zou S, Zhang Y, Zhang J, Zhang P, Xiao L, Xie Y, Meng M, Feng J, Kang L, Lee MH, Fang L. ACTL6A protects gastric cancer cells against ferroptosis through induction of glutathione synthesis. Nat Commun. 2023 Jul 13;14(1):4193. doi: 10.1038/s41467-023-39901-8. PMID: 37443154; PMCID: PMC10345109.