文獻解讀：Tmem119Cre基因敲入小鼠助力發(fā)現(xiàn)單核細胞具備增殖能力

復(fù)雜的生物體（包括人類）是從單個細胞產(chǎn)生的，因此細胞分裂和增殖的能力很關(guān)鍵。眾所周知，構(gòu)成人體的大多數(shù)細胞都來自干細胞，它們不斷分裂，產(chǎn)生更多的細胞。之后，這些細胞停止增殖，并分化成各種特化細胞，形成組織和器官。若細胞增殖出現(xiàn)調(diào)控不當(dāng)，則會引起各種各樣的疾病，癌癥就是最明顯的例子。

比利時列日大學(xué)的研究人員近日發(fā)現(xiàn)，這種增殖能力不僅限于干細胞，血液中的單核細胞也具備增殖能力，這是以往未發(fā)現(xiàn)的。單核細胞能夠在局部增殖，然后分化成不同的間質(zhì)巨噬細胞亞群。這項研究成果于近日發(fā)表在《Nature Immunology》雜志上，揭示了單核細胞的一種新功能。

圖片來源：《Nature Immunology》
（https://doi.org/10.1038/s41590-023-01468-3）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員構(gòu)建了肺間質(zhì)巨噬細胞生態(tài)位耗竭的小鼠模型（IM^DTR），其中Tmem119^Cre基因敲入小鼠由賽業(yè)生物提供。在利用白喉毒素處理IM^DTR小鼠后，研究者采用單細胞測序分析比較了處理和未處理小鼠的單核細胞和間質(zhì)巨噬細胞，并開展了單細胞RNA速率分析。通過Monocle、tradeSeq和擬時間分析，研究者評估了間質(zhì)巨噬細胞的發(fā)育軌跡。

技術(shù)路線
01構(gòu)建肺間質(zhì)巨噬細胞生態(tài)位耗竭的小鼠模型IM^DTR，并證實單核細胞在生態(tài)位耗竭時可產(chǎn)生間質(zhì)巨噬細胞亞群
02通過單細胞RNA測序和分析獲得從單核細胞到間質(zhì)巨噬細胞的軌跡
03分析發(fā)現(xiàn)過渡的單核細胞以Csf1r依賴性的方式在局部增殖
04在深入分析表達調(diào)控后，發(fā)現(xiàn)單核細胞的增殖受到MafB調(diào)控

研究結(jié)果
1.單核細胞在生態(tài)位耗竭時產(chǎn)生間質(zhì)巨噬細胞亞群
組織駐留巨噬細胞（RTM）是一種分化的免疫細胞，它們占據(jù)不同的生態(tài)位并發(fā)揮著重要的組織支持功能。盡管目前認為RTM生態(tài)位的維持是通過單核細胞的分化或成熟RTM的自我更新來實現(xiàn)的，但RTM在穩(wěn)態(tài)下緩慢更替，且缺乏合適的模型，這都阻礙了對RTM動態(tài)的研究。

肺間質(zhì)巨噬細胞（IM）是一種長壽命的組織駐留巨噬細胞，在成人體內(nèi)由Ly6C⁺經(jīng)典單核細胞（cMo）緩慢補充，具體包括血管周圍CD206⁺ IM和神經(jīng)相關(guān)CD206^- IM，可作為研究單核細胞到RTM軌跡的模型。因此，研究人員在本研究中利用小鼠肺間質(zhì)巨噬細胞生態(tài)位耗竭和再次填充模型來研究間質(zhì)巨噬細胞在體內(nèi)的發(fā)育。

研究者發(fā)現(xiàn)，肺間質(zhì)巨噬細胞高水平表達跨膜蛋白119的編碼基因（Tmem119）和fractalkine受體的編碼基因（Cx3cr1）。于是，研究者將Tmem119^Cre小鼠（由賽業(yè)生物提供）和Cx3cr1^LSL-DTR小鼠雜交，構(gòu)建了白喉毒素（DT）誘導(dǎo)的肺IM生態(tài)位耗竭的轉(zhuǎn)基因小鼠模型（IM^DTR）。向IM^DTR小鼠的腹腔注射白喉毒素24小時后，CD206⁺ IM和CD206^- IM亞群被有效清空。

與對照組相比，IM^DTR小鼠在處理后第2天和第3天的IM數(shù)量仍然很低，但肺部cMo數(shù)量顯著增加。從第3天起，IM數(shù)量逐漸增加，在第7天達到與對照組小鼠相似的水平。同時，IM^DTR小鼠肺部和血清中的單核細胞趨化因子Ccl2含量在處理后顯著增加，表明cMo是通過Ccr2依賴性方式被吸引到肺部的。通過一系列實驗，研究者證實cMo可在白喉毒素處理后的IM^DTR小鼠中產(chǎn)生分化的CD206⁺ IM和CD206^- IM亞群。

2.從單核細胞到間質(zhì)巨噬細胞的軌跡
從單核細胞到肺間質(zhì)巨噬細胞，這中間有著怎樣的軌跡？對于分選自IM^DTR小鼠的單核細胞和間質(zhì)巨噬細胞，研究人員開展了單細胞RNA測序（scRNA-seq）分析。研究者總共分析了15,000多個髓系細胞，并鑒定出七個不同的細胞簇（圖1）。根據(jù)差異表達分析，研究者確定了與不同細胞相對應(yīng)的細胞簇，包括cMo（C1）、pMo（C2）、CD206^- IM（C3）和CD206⁺ IM（C4），而C6則代表過渡的單核細胞（Tr-Mo）。RNA速率分析也表明，Tr-Mo是從cMo向IM亞群移動（圖1f）。這些實驗在單細胞轉(zhuǎn)錄組水平上捕捉到了從單核細胞到間質(zhì)巨噬細胞的完整軌跡。

scRNA-seq分析揭示了不同的過渡細胞^[1]

3.過渡的單核細胞以Csf1r依賴性的方式在局部增殖
研究人員接著對scRNA-seq數(shù)據(jù)開展了Monocle單細胞軌跡分析，并發(fā)現(xiàn)了兩條主要軌跡，都是從cMo開始，穿過Tr-Mo到達分叉點，然后向CD206^- IM或CD206⁺ IM分叉，與實時分析結(jié)果一致（圖2）。此外，研究者還觀察到與細胞增殖相關(guān)的基因（比如Ube2c、Aurkb、Racgap1、Cdk1等）出現(xiàn)上調(diào)，并與Tr-Mo的S和G2/M細胞周期評分升高相對應(yīng)，表明存在DNA復(fù)制和有絲分裂。通過繪制cMo特征、S期和G2/M期以及IM特征的擬時間圖，研究者發(fā)現(xiàn)cMo一旦進入空的生態(tài)位就會變成Tr-Mo，然后重新進入細胞周期并擴增，最后分化成CD206^- IM或CD206⁺ IM。
 

間質(zhì)巨噬細胞發(fā)育的軌跡分析鑒定出瞬時增殖的單核細胞^[1]

之后通過EdU標記，研究人員在IM^DTR小鼠體內(nèi)檢測到過渡的單核細胞。EdU⁺CD64⁺細胞代表了在局部增殖的單核細胞，并處于從cMo到分化的IM之間的過渡狀態(tài)。考慮到Csf1受體（Csf1r）信號通路在調(diào)控單核細胞增殖中發(fā)揮重要作用，研究者在白喉毒素處理后對IM^DTR小鼠注射Csf1r抗體。在注射抗體后，小鼠中EdU⁺CD64⁺細胞的比例明顯下降，表明這些細胞在分化成IM之前通過Csf1r依賴性機制在組織中增殖。

4.單核細胞的增殖受MafB調(diào)控
為了深入了解Tr-Mo增殖和IM分化間的平衡受到哪些調(diào)控，研究者運用SCENIC算法來繪制基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。MafB是CD206⁺ IM中得分最高的轉(zhuǎn)錄因子之一，研究者認為MafB的激活可能限制了Tr-Mo增殖，并促進其發(fā)育成IM。與cMo相比，增殖單核細胞中的MafB表達減少，而IM中的MafB表達增加。通過構(gòu)建Mafb髓系條件性敲除小鼠，研究者發(fā)現(xiàn)髓系限制性的Mafb缺乏嚴重影響了cMo重新填充IM亞群生態(tài)位的能力（圖3）。這些結(jié)果說明，單核細胞增殖需要低水平MafB表達，而隨后MafB的表達增加會限制增殖并促進其分化為IM。最后，研究者還發(fā)現(xiàn)CD206⁺ IM亞群的特征受到轉(zhuǎn)錄因子c-Maf調(diào)節(jié)。
 

MafB限制增殖并介導(dǎo)間質(zhì)巨噬細胞發(fā)育^[1]

研究結(jié)論
總的來說，研究人員通過一系列研究發(fā)現(xiàn)單核細胞能夠在空的生態(tài)位中以受到MafB限制的方式增殖，然后分化成不同的間質(zhì)巨噬細胞亞群。研究者創(chuàng)新性地使用了一種肺間質(zhì)巨噬細胞生態(tài)位耗竭和重新填充模型，進而捕捉到在穩(wěn)態(tài)環(huán)境下難以獲得的結(jié)果。這些結(jié)果提供了新線索，有助于了解單核細胞增殖與組織駐留巨噬細胞分化之間的復(fù)雜調(diào)控。

原文檢索：
[1]Vanneste, D., Bai, Q., Hasan, S. et al. MafB-restricted local monocyte proliferation precedes lung interstitial macrophage differentiation. Nat Immunol 24, 827–840 (2023). https://doi.org/10.1038/s41590-023-01468-3