細胞端粒酶活性檢測之細胞成瘤性檢測介紹

瀏覽次數(shù)：489　發(fā)布日期：2023-10-24　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負

細胞端粒酶活性檢測——細胞成瘤性檢測

一、端粒

端粒（telomere）位于真核細胞染色體末端，其 DNA 序列高度保守。端�？蓽p少末端縮短，亦可避免相鄰染色體末端融合，在細胞增殖及衰老等過程中發(fā)揮重要作用。人體細胞每分裂 1 次，端�？s短 50～100 bp，當(dāng)端粒長度縮短到傷害 DNA 的臨界值而細胞又無法補償此長度縮短時，染色體穩(wěn)定性變差，最終導(dǎo)致細胞死亡、機體衰老。

二、端粒酶

端粒酶是一種RNA依賴性DNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶，由RNA和蛋白質(zhì)組成，可維持端粒長度（Greider and Blackburn 1989）。端粒酶以自身RNA為模板，合成端粒DNA，從而使細胞獲得無限增殖。其主要由 3 部分組成[即人端粒酶RNA（humane telomerase RNA component, hTERC）、端粒酶協(xié)同蛋白（humane telomerase associated protein, hTEP1）及端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（human e telomerase reverse transcriptase, hTERT）]，其中hTERT被認為是端粒酶活性表達的關(guān)鍵組分，hTERT編碼的 mRNA 水平與端粒酶整體活性一致。因此，可以用hTERT亞基的mRNA水平基因表達量來衡量端粒酶活性。hTERT和hTERC對于端粒維持和延伸的催化活性是必要和充分的（Lingn er等, 1997; Weinrich等, 1997）。DKC1是端粒酶復(fù)合體的一個重要組成部分，屬于協(xié)同蛋白之一，在正常端粒功能的維持、前體rRNA的加工、正常核糖體生物合成以及基因轉(zhuǎn)錄后修飾等過程中發(fā)揮重要作用。

三、端粒酶活性的組織特異性

端粒酶在細胞中的主要生物學(xué)功能是通過其逆轉(zhuǎn)錄酶活性復(fù)制和延長端粒DNA，穩(wěn)定染色體端粒DNA的長度。端粒酶的活性在真核細胞中可檢測到，其功能是合成染色體末端的端粒，使因每次細胞分裂而逐漸縮短的端粒長度得以補償，進而穩(wěn)定端粒長度。

然而，大多數(shù)人類體細胞并不主動表達這種酶。在人類研究中，一些常用于分析端粒長度的細胞類型是血淋巴細胞和其他單核細胞，通常稱為外周血單核細胞（PBMC）。這些細胞被激活時能夠上調(diào)端粒酶活性。端粒長度和端粒酶活性這兩個因素都是在不同的分子水平上獨立調(diào)節(jié)的，它們之間復(fù)雜的相互作用還不完全清楚，例如氧化應(yīng)激、TPE和TERRA都會干擾它們。

端粒酶-酶復(fù)合物的高度保守和嚴格調(diào)控的催化亞基TERT通過RNA模板反向轉(zhuǎn)錄端粒六核苷酸來維持和恢復(fù)端粒長度（Smogorzewska and Delange, 2004）。然而，人體內(nèi)只有生殖干細胞和癌細胞表達足夠水平的端粒酶以完全維持端粒長度（Kim等, 1994）。人端粒酶以組織特異性方式表達，并在衰老過程中減少端粒酶陽性的細胞類型（Lin等, 2015；Young等, 2003）。人胚胎組織中，端粒酶活性最高，并且隨著年齡增長，端粒酶活性逐漸降低（肝臟組織除外）。在某些成人細胞如淋巴細胞、內(nèi)皮細胞和成人干細胞中仍可檢測到端粒酶活性。生殖細胞中的端粒酶活性也很高，因為需要確保后代的端粒足夠長。而胚胎干細胞也具有高端粒酶活性的特點，這是其能夠在細胞培養(yǎng)條件下在體外持續(xù)生長的基礎(chǔ)。

腫瘤發(fā)生過程中，端粒酶活性高度上調(diào)，在大多數(shù)癌癥腫瘤組織中，端粒酶活性較高。這種活性升高的狀態(tài)，使得端粒長度得以維持，即使在癌細胞中端粒長度很短，也能使細胞無限期生長。因此，端粒酶活性是細胞永生的重要先決條件。

四、檢測意義

1、臨床上：可檢測是否有腫瘤

2、工業(yè)客戶：間接考察細胞是否有成瘤的可能性

五、端粒酶活性檢測的主要方案

1、直接檢測端粒酶（蛋白及RNA的結(jié)合復(fù)合物）的活性，檢測它是否可以延伸DNA模板，然后跑膠或者探針雜交，檢測DNA延伸的長度，以此來判斷端粒酶的活性高低。（TRAP法）

優(yōu)缺點：該方法需要提取蛋白，操作較復(fù)雜，靈敏度不高；放射性同位素標(biāo)記；重復(fù)性差、周期長等。

2、間接檢測端粒酶（催化亞基的mRNA量）的活性。

優(yōu)缺點：該方法靈敏度高，操作相對簡便；但是在多數(shù)細胞中，端粒酶催化亞基的表達很難檢測到。

六、翼和端粒酶活性檢測

1、檢測原理

雙色熒光探針分別檢測端粒酶催化亞基TERT基因mRNA和內(nèi)參基因GAPDH mRNA。在進行樣本檢測時，同時檢測陽性細胞293T和陰性MRC-5細胞做為對照，利用∆∆CT法計算樣本中TERT基因的相對表達量。

2、檢測結(jié)果展示