造血-間充質(zhì)信號調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的特性

骨髓間充質(zhì)干/基質(zhì)細(xì)胞（MSCs）存在于骨髓中，具有高度的自我復(fù)制能力和多向分化潛能，可分化成多種細(xì)胞，是再生醫(yī)學(xué)中臨床上使用最多的干細(xì)胞之一。然而，間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓中僅有少量存在（約為兩百萬分之一），為了獲得所需數(shù)量的細(xì)胞，必須培養(yǎng)MSCs才能擴(kuò)增，但這會導(dǎo)致干細(xì)胞特性（干性）顯著降低，例如分化多能性和增殖能力。目前，旨在闡明MSC自我更新和干性維持的分子機(jī)制的研究正在取得進(jìn)展。然而，在維持干細(xì)胞干性的同時(shí)建立培養(yǎng)MSCs的方法仍然具有挑戰(zhàn)性。如果能夠建立這樣的方法，MSCs在臨床應(yīng)用中的使用將大大擴(kuò)展。

骨髓中的間充質(zhì)細(xì)胞提供了一個(gè)稱為生態(tài)位（niche）的微環(huán)境，其中造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞（HSCs）的干性由各種因素維持，例如C-X-C基序趨化因子配體12（CXCL12）和透明質(zhì)酸。這些間充質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為對應(yīng)于巢蛋白陽性細(xì)胞、N-鈣黏蛋白陽性細(xì)胞、CD31陽性細(xì)胞和表達(dá)CXCL12的網(wǎng)狀細(xì)胞。眾所周知，促血小板生成素（TPO）對巨核細(xì)胞生成至關(guān)重要，有助于HSCs的維持和擴(kuò)增。缺少TPO或其受體（c-Mpl）的小鼠不僅顯示巨核生成受損，而且HSC數(shù)量和功能降低。最近的報(bào)道表明，需要TPO來維持骨髓內(nèi)HSCs的靜息狀態(tài)。

細(xì)胞間相互作用在各個(gè)發(fā)育階段和組織穩(wěn)態(tài)維持中起著關(guān)鍵作用。在個(gè)體發(fā)育和器官發(fā)展過程中，不同胚層的細(xì)胞之間經(jīng)常觀察到這種相互作用。研究表明，從HSCs到MSCs的干性信號也存在，作為間充質(zhì)譜系HSCs的干性信號的對應(yīng)物。因此，東京大學(xué)醫(yī)學(xué)部口腔頜面外科、東京醫(yī)科齒科大學(xué)齒學(xué)研究科以及德克薩斯大學(xué)休斯頓健康科學(xué)中心的聯(lián)合研究人員假設(shè)TPO / c-Mpl信號對于從HSCs到間充質(zhì)細(xì)胞的干性信號也很重要，在一項(xiàng)研究中，利用c-Mpl缺失小鼠來檢測HSCs和MSCs中c-Mpl缺失對其增殖能力和干性維持的影響。相關(guān)研究成果發(fā)表在 International Journal of Molecular Sciences 期刊題為“Hematopoietic-Mesenchymal Signals Regulate the Properties of Mesenchymal Stem Cells”。

首先，為了驗(yàn)證造血-間充質(zhì)細(xì)胞相互作用的存在，將表達(dá)EGFP的小鼠骨髓來源的間充質(zhì)細(xì)胞（BM細(xì)胞）與人急性骨髓性白血病細(xì)胞（KG-1細(xì)胞系）共培養(yǎng)，然后計(jì)算了一段時(shí)間內(nèi)共培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)與KG-1細(xì)胞的直接共培養(yǎng)刺激了BM細(xì)胞的增殖。相比之下，間接共培養(yǎng)對BM細(xì)胞增殖影響不大（圖1 A、B）。KG-1細(xì)胞增殖不受與BM細(xì)胞共培養(yǎng)的影響（圖1 A、B）。

已知MSCs 在體外培養(yǎng)過程中會經(jīng)歷加速分化。有和沒有與KG-1細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞之間的形態(tài)無顯著差異（圖1 C）。因此，檢測了血小板衍生生長因子受體（PDGFR）α 和干細(xì)胞抗原-1（Sca-1）以及MSC特異性標(biāo)志物在小鼠中的表達(dá)。在與KG-1細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞（BM細(xì)胞+ KG-1細(xì)胞）中表達(dá)PDGFR-α和Sca-1的細(xì)胞比例明顯高于未與KG-1細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞（BM細(xì)胞）（圖1 D）。然后進(jìn)一步研究了共培養(yǎng)對多譜系分化能力的影響。共培養(yǎng)后誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞分化，在BM細(xì)胞中觀察到Sox9的表達(dá)（圖1 E）。這些數(shù)據(jù)表明，BM細(xì)胞與KG-1細(xì)胞的共培養(yǎng)可促進(jìn)其增殖和軟骨細(xì)胞分化能力。

圖1 間充質(zhì)-造血細(xì)胞相互作用促進(jìn)BM細(xì)胞增殖。

接下來，為了再次確認(rèn)造血-間充質(zhì)細(xì)胞相互作用對MSCs的影響，實(shí)驗(yàn)評估了與HSCs共培養(yǎng)過程中MSC特性的變化。結(jié)果表明，與HSCs直接共培養(yǎng)促進(jìn)了MSCs的增殖，而間接共培養(yǎng)無影響。有趣的是，造血細(xì)胞顯示出細(xì)胞數(shù)量的顯著增加，特別是在在間接共培養(yǎng)過程中。然后檢測了它們在共培養(yǎng)增殖的間充質(zhì)和造血細(xì)胞中的比例，觀察到從第0天開始，MSC標(biāo)記陽性細(xì)胞顯示出隨時(shí)間而略有增加的趨勢，而HSCs細(xì)胞的數(shù)量在共培養(yǎng)后立即大幅下降。此外，還評估了MSCs在共培養(yǎng)后的多能性，觀察到在誘導(dǎo)成骨、成脂和成軟骨分化后，各分化標(biāo)志物的表達(dá)上調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，直接間充質(zhì)-造血細(xì)胞相互作用促進(jìn)了MSCs的干性，而且從HSCs 轉(zhuǎn)變到MSCs 時(shí)存在一個(gè)信號。

為了更詳細(xì)地研究HSC信號對MSCs的影響，使用微陣列分析檢查了與HSCs共培養(yǎng)后MSCs的基因表達(dá)譜。在MSC和HSC共培養(yǎng)組和僅MSC組（對照）中，觀察到轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)。這些MSCs表達(dá)SRCIN1、BNC1和PCK1。SRCIN1調(diào)節(jié)細(xì)胞擴(kuò)增和遷移；BNC1參與卵母細(xì)胞成熟的正向調(diào)節(jié)，也可能在胚胎的早期發(fā)育中發(fā)揮作用；PCK1通過其蛋白激酶活性調(diào)節(jié)脂肪生成�；�于此，HSCs可能具有維持MSCs的未分化特性和代謝的潛力。此外，還分析了差異表達(dá)基因（DEGs）。然而，在對照組與共培養(yǎng)組之間未觀察到DEGs。然后進(jìn)行了基因集富集分析（GSEA）以檢測信號趨勢。對C2_curated基因集（標(biāo)志性基因集）進(jìn)行分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以下富集的基因存在顯著差異：“I型膠原蛋白合成”、“脂肪生成”、“Wnt blocked by Frizzled”和“H3K27me3”，這些基因在共培養(yǎng)的MSCs中受到抑制。GSEA分析結(jié)果支持HSC信號可能會影響MSC特性。

據(jù)報(bào)道，MPL信號是維持HSCs未分化狀態(tài)的直接機(jī)制之一。為了確定c-Mpl缺失小鼠的干性信號對MSCs的影響，分析了c-Mpl敲除小鼠的細(xì)胞。首先，從c-MPL缺失和野生型小鼠中收獲MSCs，以檢查HSC缺失對MSCs的影響。在CFU-F測定中，c-Mpl缺失小鼠來源的MSCs顯示出與野生型小鼠細(xì)胞相當(dāng)?shù)募�落形成能力（圖2 A、B）。當(dāng)收獲的細(xì)胞傳代培養(yǎng)時(shí)，兩種細(xì)胞類型之間的增殖能力或PDGFR-α/Sca-1陽性細(xì)胞的比例沒有顯著差異（圖2 C、D）。此外，通過實(shí)時(shí)RT-PCR檢測MSCs的多能性，驚訝的是，在c-Mpl缺失小鼠來源的MSCs中觀察到軟骨標(biāo)志物表達(dá)的顯著增加。雖然兩組之間成骨標(biāo)志物和成脂標(biāo)志物的表達(dá)沒有顯著差異，但這些標(biāo)志物在c-Mpl缺失小鼠的MSCs中往往更高（圖2 E-G）。這些結(jié)果表明，c-Mpl缺失的MSCs在體外表現(xiàn)出增強(qiáng)的分化活性。

圖2 c-MPL缺失的MSCs具有正常的增殖和分化潛力。

然后，在體內(nèi)評估了來自c-Mpl缺失和野生型小鼠的MSCs的成骨特性，顯示c-Mpl-WT和c-缺失的MSCs在移植后早期出現(xiàn)骨形成。然而，c-Mpl缺失小鼠來源的MSCs比野生型MSCs更早地促進(jìn)骨形成。蘇木精和伊紅染色顯示第 2 周和 4 周均存在移植物。這說明，c-MPL 基因缺失影響異位骨的維持。

最后，為了研究HSCs的干性與HSCs到MSCs的干性信號之間的關(guān)系，將野生型MSCs與野生型小鼠HSCs或c-Mpl缺失小鼠的HSCs共培養(yǎng)。與HSCs共培養(yǎng)（c-Mpl野生型（WT）和c-Mpl敲除（KO））共培養(yǎng)后，MSCs的集落形成能力不受c-Mpl缺失的影響（圖3 A）。然而，與c-Mpl缺失小鼠的HSCs共培養(yǎng)未能刺激MSC增殖（圖3 B）。在未共培養(yǎng)的MSCs中，盡管Sca-1和PDGFR-α陽性率在培養(yǎng)后立即下降，但從第0天到第6天幾乎保持不變（圖3 C）。在與野生型HSCs共培養(yǎng)的野生型MSCs中，盡管Sca-1和PDGFR-α的陽性率從-2天到第0天暫時(shí)下降，但在第3天恢復(fù)并維持在40%左右（圖3 C）。然后，檢測了與c-Mpl缺失或野生型小鼠HSCs共培養(yǎng)的MSCs的多能性。與c-Mpl缺失小鼠的HSCs共培養(yǎng)的MSCs中成脂標(biāo)志物水平顯著更高，軟骨細(xì)胞分化標(biāo)志物的水平也更高。兩組成骨標(biāo)志物表達(dá)相似（圖3 D）。因此，可以認(rèn)為在HSCs中，c-Mpl會影響MSCs增殖能力的維持。

綜上所述，這項(xiàng)研究驗(yàn)證了從造血細(xì)胞到間充質(zhì)細(xì)胞的干性信號。此外，這表明HSCs的干性對于維持MSCs的干性很重要。該研究結(jié)果可能有助于建立一種利用干性信號來擴(kuò)增具有高干性的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，從而為再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展做出貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：Kanazawa S, Okada H, Riu D, Mabuchi Y, Akazawa C, Iwata J, Hoshi K, Hikita A. Hematopoietic-Mesenchymal Signals Regulate the Properties of Mesenchymal Stem Cells. Int J Mol Sci. 2022 Jul 26;23(15):8238. doi: 10.3390/ijms23158238. PMID: 35897814; PMCID: PMC9330127.

原文鏈接：Hematopoietic-Mesenchymal Signals Regulate the Properties of Mesenchymal Stem Cells - PubMed

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