NK-92人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細(xì)胞培養(yǎng)教程

--細(xì) 胞 基 本 信 息---
細(xì)胞名稱： NK-92(人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細(xì)胞)
細(xì)胞別稱： NK92; Natural Killer-92; NK-92.05; Neukoplast; aNK
細(xì)胞貨號： SNL-405
生長特性： 懸浮
培養(yǎng)條件： MEMα+20% FBS+0.2mM Inositol+0.1mM β-mercaptoethanol+0.02mM Folic Acid+100-200U/mL recombinant IL-2+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境： 空氣，95%； 二氧化碳 (CO2)，5%；37℃
細(xì)胞簡介： NK-92細(xì)胞是從一位患有急進(jìn)性非霍奇金淋巴瘤的50歲白人男性外周血單核細(xì)胞衍生來的一株IL-2依賴型NK細(xì)胞株。NK-92細(xì)胞對很多惡性細(xì)胞有細(xì)胞毒性，鉻釋放試驗顯示它能殺死K562細(xì)胞和Daudi細(xì)胞。NK-92細(xì)胞(經(jīng)過照射以防止增殖)可以有效地用于血液中白血病的體外免疫清掃而不危及血細(xì)胞的功能。NK-92細(xì)胞有以下特征：CD2、CD7、CD11a、CD28、CD45、CD54表面標(biāo)記陽性；CD1、CD3、CD4、CD5、CD8、CD10、CD14、CD16、CD19、CD20、CD23、CD34和HLA-DR表面標(biāo)記陰性。NK-92細(xì)胞依賴于重組IL-2的存在，低至10U/mL的劑量足以維持增殖；在缺乏IL-2的情況下，細(xì)胞將在72小時內(nèi)死亡。ATCC通過PCR證實該細(xì)胞系Epstein-Barr病毒DNA序列呈陽性。NK-92細(xì)胞可以用于3D細(xì)胞培養(yǎng)、免疫學(xué)研究、毒理研究，也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。
 
細(xì)胞正常生長形態(tài)照片  
NK-92細(xì)胞培養(yǎng)注意事項
 

• NK-92細(xì)胞呈聚團(tuán)懸浮生長，細(xì)胞團(tuán)較大時需要吹打成小團(tuán)，防止團(tuán)塊中間的細(xì)胞因營養(yǎng)不足而死亡。除非實驗需要，不建議經(jīng)常將細(xì)胞吹散成單個細(xì)胞，否則細(xì)胞狀態(tài)將變差；
• NK-92細(xì)胞對培養(yǎng)基和血清要求高，培養(yǎng)基嚴(yán)格按照配方配制，并且應(yīng)該使用優(yōu)質(zhì)血清進(jìn)行培養(yǎng)；
• NK-92細(xì)胞對IL-2有依賴性，如果缺少IL-2細(xì)胞將很快死亡。需注意IL-2容易降解，若購買商品化完全培養(yǎng)基，要保存得當(dāng)并在保質(zhì)期內(nèi)盡快用完；若自己配制培養(yǎng)基，IL-2可以采用現(xiàn)配現(xiàn)用的方法；
• 建議常備IL-2，當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)不佳時，額外向培養(yǎng)基中按200U/mL補(bǔ)充IL-2，可有效改善。
• NK-92細(xì)胞對吹打等機(jī)械刺激敏感，不要吹打太多次，注意控制吹打力度輕柔；
• NK-92細(xì)胞對溫度敏感，培養(yǎng)基、PBS需復(fù)溫至37℃再使用。
• NK-92細(xì)胞凍存難度較大，建議使用90% FBS+10%DMSO凍存液，凍存密度推薦300萬細(xì)胞/毫升，不能過低。凍存液中不必加IL-2。凍存時細(xì)胞應(yīng)吹散成單細(xì)胞。
• NK-92細(xì)胞計數(shù)時算得的細(xì)胞的活率不能代表該細(xì)胞真實的狀態(tài)。因為培養(yǎng)時存在一些散在的單細(xì)胞，這些細(xì)胞活性較低，且不能完全去除，導(dǎo)致在計數(shù)時細(xì)胞整體活率可能不高。細(xì)胞狀態(tài)可以通過細(xì)胞能否聚團(tuán)判斷：只要大部分細(xì)胞能聚團(tuán)生長，細(xì)胞狀態(tài)就沒有問題。當(dāng)細(xì)胞狀態(tài)不佳時，細(xì)胞無法順利聚團(tuán)。

 
NK-92細(xì)胞換液方法
 

• 半換液法：

• 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等；（培養(yǎng)基提前預(yù)熱）
• 將培養(yǎng)瓶豎立靜置一段時間，待細(xì)胞沉底；（肉眼觀察細(xì)胞沉底情況）
• 吸頭緊貼液面，小心吸出一半的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到離心管；
• 900-1000rpm 3min離心，離心管里若有細(xì)胞，則用新鮮培養(yǎng)基重懸后放回原瓶；
• 原瓶補(bǔ)充一半的新鮮培養(yǎng)基。

Tips：建議半換液2-3次后進(jìn)行離心換液。
 

• 離心換液法：

• 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等；（培養(yǎng)基提前預(yù)熱）
• 將所有細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中；
• 900-1000rpm，3min離心；
• 棄上清，加5mL PBS輕輕重懸細(xì)胞進(jìn)行潤洗，再900-1000rpm，3min離心；

Tips：此處PBS潤洗是為了去除細(xì)胞碎片，平時培養(yǎng)若細(xì)胞碎片不多可以忽略此步驟。

• 培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；
• 離心完成后棄上清，加適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞懸液接種回培養(yǎng)瓶中，混勻細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

 
NK-92細(xì)胞傳代方法
 

• 離心法：

• 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、離心管以及無菌槍頭等；（培養(yǎng)基提前預(yù)熱）
• 用移液器吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中；
• 900-1000rpm，3min離心收集細(xì)胞；
• 在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；（T25推薦10mL，T75推薦20mL）
• 離心完成后，棄離心管內(nèi)上清，然后加入適量新鮮培養(yǎng)基，輕輕重懸吹散細(xì)胞，將細(xì)胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

 

• 直接分瓶法：

• 輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞均勻分散；若有較大的細(xì)胞團(tuán)，需吹散成小團(tuán)。
• 用移液器吸取培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞懸液，均分到若干個新培養(yǎng)瓶中，每瓶再補(bǔ)充適量的新鮮培養(yǎng)基，輕輕混勻后將細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

Tips：

• 注意控制吹打力度盡可能輕柔和離心轉(zhuǎn)速以及時間不要過高，避免細(xì)胞受機(jī)械損傷。
• 傳代比例推薦1：2

 
NK-92細(xì)胞凍存方法
 

• 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、PBS、血清、DMSO、離心管以及無菌槍頭等；（試劑需提前預(yù)熱）

Tips：若凍存前培養(yǎng)基已經(jīng)變黃，先換液靜置培養(yǎng)4h左右，待細(xì)胞活力穩(wěn)定后再進(jìn)行凍存。

• 根據(jù)收集到細(xì)胞量，配制相應(yīng)量的凍存液，并準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的凍存管，在凍存管上標(biāo)志細(xì)胞名稱，代次，凍存時間等信息。推薦凍存液配方：90%FBS+10%DMSO；凍存密度300萬細(xì)胞/mL/管。

Tips：凍存密度過低將導(dǎo)致復(fù)蘇后狀態(tài)不佳。

• 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中1000rpm，3min離心收集細(xì)胞；
• 離心完成后棄上清，加入相應(yīng)量的配置好的凍存液輕輕重懸混勻細(xì)胞，將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中。注意吹打力度，不要產(chǎn)生過多氣泡；

Tips：加入凍存液混勻細(xì)胞后及時分裝并將細(xì)胞降溫凍存，以減少DMSO對細(xì)胞的毒性。

• 將細(xì)胞放置程序降溫凍存盒中，再將凍存盒轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱進(jìn)行降溫凍存。
• 次日（16h-24h后）復(fù)蘇一管檢查凍存效果，確認(rèn)沒問題后及時將凍存細(xì)胞放置液氮中保存，細(xì)胞在-80℃冰箱放置時間不要超過3天。

 
NK-92細(xì)胞復(fù)蘇方法
 

• 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃，培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃，離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速；
• 將凍存細(xì)胞從液氮或-80℃冰箱中取出，迅速置于37℃水浴，快速搖晃至完全融化，融化時間不超過2min；

Tips：

• 若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn)，細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運送至細(xì)胞房。

• 水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染。

• 直接將凍存管900-1000rpm 2min離心，同時在培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；
• 離心完成后棄上清，吸取1mL新鮮培養(yǎng)基（建議血清濃度提高至20%）輕輕重懸細(xì)胞，吹散細(xì)胞后接種到培養(yǎng)瓶中；
• 使用十字法或8字法將細(xì)胞混勻后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

Tips：整個細(xì)胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。
 
NK-92細(xì)胞收貨攻略
 

• 拆封包裝盒，確認(rèn)細(xì)胞，說明書等是否齊全，收貨細(xì)胞名與所購買細(xì)胞是否符合；
• 觀察細(xì)胞培養(yǎng)瓶是否完好，有無漏液，培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基是否有肉眼可見的絮狀物或者渾濁等，發(fā)現(xiàn)異常及時拍照聯(lián)系銷售人員；
• 確認(rèn)無異常后，將培養(yǎng)瓶表面消毒，然后撕掉封口膜豎立放入培養(yǎng)箱平衡4h左右，讓懸浮細(xì)胞沉下培養(yǎng)瓶底部；
• 平衡過程中可以仔細(xì)閱讀細(xì)胞說明書，知悉細(xì)胞所需培養(yǎng)體系，培養(yǎng)環(huán)境以及培養(yǎng)注意事項等；
• 平衡完成后豎立取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，此時大部分細(xì)胞沉在培養(yǎng)瓶底部，小心吸取上清至離心管中，保留10mL左右培養(yǎng)基在培養(yǎng)瓶內(nèi)，小心操作，盡量不要吸到沉在底部的細(xì)胞；
• 將離心管1200rpm，5min離心收集未沉下培養(yǎng)瓶底部的細(xì)胞，上清可以4℃保存，后續(xù)用于培養(yǎng)細(xì)胞，以平穩(wěn)過度到自己的培養(yǎng)基。將收集到的細(xì)胞接種至原培養(yǎng)瓶；
• 觀察細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，以及團(tuán)塊數(shù)量、大小決定傳代或繼續(xù)培養(yǎng)。

 
常見問題及解決方案

培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理？

• 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，這個屬于細(xì)胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細(xì)胞都會有這種現(xiàn)象，只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別，細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。
• 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物，可通過900-1000rpm，3min離心以去除部分碎片。少量碎片不影響細(xì)胞生長，不建議頻繁離心。

 
產(chǎn)品推薦：
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