轉(zhuǎn)錄組分析在揭示過量草酸抑制廣葉繡球菌腐生生長的機(jī)制研究中的應(yīng)用

文章標(biāo)題：Transcriptome Analysis Revealed the Mechanism of Inhibition of Saprophytic Growth of Sparassis latifolia by Excessive Oxalic Acid
發(fā)表期刊：cells
影響因子：6.0
技術(shù)平臺：轉(zhuǎn)錄組測序，qRT-PCR

研究背景
廣葉繡球菌(Sparassis latifolia)是一種價值極高的食用菌，具有豐富的活性成分和藥理作用，是一種重要的藥用和食品資源。廣葉繡球菌是亞洲廣泛種植和消費的商業(yè)蘑菇，但菌絲生長速度慢嚴(yán)重制約了其栽培規(guī)模的擴(kuò)大。對底物的利用是直接了解菌絲生長的關(guān)鍵，以往研究發(fā)現(xiàn)其菌絲在生長過程中分泌大量草酸(Oxalic acid, OA)，草酸可以抑制菌絲生長。然而，在腐生植物生長過程中，對草酸生長速率的機(jī)制尚未深入闡明。目前還沒有研究人員著重研究廣葉繡球菌腐生生長緩慢的原因以及草酸對其菌絲生長緩慢的抑制作用。本研究利用illumina測序技術(shù)檢測了不同草酸濃度下廣葉繡球菌菌絲生長速率的差異特性，為闡明腐生過程中菌絲生長緩慢的機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)。

結(jié)果
1. 不同草酸濃度下廣葉繡球菌菌絲生長的研究
在不同草酸濃度的松木木屑培養(yǎng)基(Pine sawdust medium, PSM)中培養(yǎng)20 d后的廣葉繡球菌菌絲表現(xiàn)出不同的生長特征。在高草酸濃度(10 mM)條件下，廣葉繡球菌菌絲菌絲生長受到明顯抑制，菌絲生長速率最低（圖1 A-C）。在PSM培養(yǎng)基中添加三氟碘甲烷(3,3-difluorooxaloacetate, IOA)，菌絲生長速率顯著提高，生長速率顯著高于其他處理（圖1 D）。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，過量的草酸會抑制廣葉繡球菌菌絲的生長，通過抑制草酸的合成降低草酸濃度進(jìn)而顯著促進(jìn)菌絲生長。

圖1. 草酸對PSM培養(yǎng)基中廣葉繡球菌菌絲體生長的影響

2. 差異基因篩選
本研究對兩兩間（對照組CK、草酸合成抑制組IOA和草酸添加組OA）的差異基因進(jìn)行篩選，OA組與CK組篩選出4478個差異基因（上調(diào)2248個、下調(diào)2030個）， IOA組與CK組篩選出1331個差異基因（上調(diào)666個、下調(diào)665個），OA組與IOA組篩選出3397個差異基因（上調(diào)2105個、下調(diào)1892個)（圖2 A、C-E）。利用差異基因繪制Venn圖，篩選出3個比較組共同或特有的差異基因（圖2 B），發(fā)現(xiàn)與OA相關(guān)的比對組中篩選到的差異基因最多，而在OA組中，廣葉繡球菌菌絲的生長速率最低，說明這些差異基因可能在菌絲生長中起著至關(guān)重要的作用。綜上所述，這些結(jié)果表明草酸濃度影響了許多基因的表達(dá)，這些基因可能與菌絲生長密切相關(guān)。
 

圖2. CK、IOA和OA處理的差異表達(dá)分析

3. 差異基因功能分析
對篩選到的基因進(jìn)行GO功能注釋。OA與CK的比較中，4478個差異基因中富集了231個GO條目，包括56個分子功能(Molecular Function, MF)， 136個生物過程(Biological Process, BP)和39個細(xì)胞成分(Cellular Component, CC) （圖3 A）。MF富集的主要條目有轉(zhuǎn)錄因子活性、電子轉(zhuǎn)移活性、泛素結(jié)合、醇脫氫酶(NAD+)活性等條目。BP富集的主要條目為有氧呼吸、細(xì)胞對熱的反應(yīng)、線粒體ATP合成耦合電子傳遞、質(zhì)子跨膜運輸、三羧酸(TCA)循環(huán)等。CC富集的主要條目為膜的組成部分、線粒體內(nèi)膜、呼吸鏈復(fù)合體等條目。IOA與CK的比較中，1331個差異基因中富集了117個GO條目，包括47個MF, 55個BP和15個CC(圖3B)。OA與IOA比較中，從3397個差異基因中富集了200個GO條目，包括43個MF, 139個BP和18個CC（圖3 C）。

圖3. 3種處理菌絲中差異基因的GO富集結(jié)果

對OA與CK、IOA與CK、OA與IOA這些比較篩選到的差異基因進(jìn)行KEGG通路富集分析（圖4 A），發(fā)現(xiàn)受草酸濃度影響的差異基因富集的KEGG通路類別為代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理、細(xì)胞過程和有機(jī)系統(tǒng)類別（圖4 B-D）。同時展示3個比較組前30條富集的KEGG通路，在不同的對照組中，這些通路中含有受高濃度草酸影響的顯著下調(diào)的差異基因（圖5）。高草酸濃度對代謝類通路影響最大，特別是對氨基酸代謝、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、輔助因子和維生素代謝、外源生物降解代謝、糖類生物合成代謝和能量代謝的影響比較大。此外，許多參與環(huán)境信息加工的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因也被廣泛抑制。因此，這些代謝途徑極有可能與廣葉繡球菌菌絲的生長有關(guān)。本研究篩選到編碼木質(zhì)纖維素降解酶的差異基因，包括內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶(mRNA_2483)、外切-葡聚糖酶(mRNA_8946)、外切-β-1,3-葡萄糖苷酶(mRNA_6544)等，與IOA組相比，CK和OA組這些編碼基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)。
 

圖4. KEGG通路分類富集分析
 

圖5. 不同比較組中TOP30 KEGG通路結(jié)果

4. 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的qRT-PCR驗證
隨機(jī)選擇3個上調(diào)和3個下調(diào)的差異基因，驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的相對表達(dá)水平。由結(jié)果可看出3個比較中，qRT-PCR基因表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯著一致，說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。
 

圖6. qRT-PCR驗證結(jié)果

結(jié)論
本研究報道了不同草酸濃度誘導(dǎo)的廣葉繡球菌轉(zhuǎn)錄組應(yīng)答。通過三組比較，共鑒定出9206個差異表達(dá)基因，其中4587個基因下調(diào)，5109個基因上調(diào)。對差異基因的功能分析發(fā)現(xiàn)，過量草酸使與碳水化合物利用途徑、能量代謝、氨基酸代謝、蛋白質(zhì)合成代謝、聚糖生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)量下調(diào)。此外，在過量草酸處理的菌絲體中，編碼木材降解酶的基因顯著下調(diào)。本研究結(jié)果為過量草酸抑制腐生植物生長提供了一種推測機(jī)制，為進(jìn)一步研究廣葉繡球菌菌絲生長奠定了基礎(chǔ)。