非靶標(biāo)代謝組+脂質(zhì)組學(xué)在乳腺癌亞型新解析中的應(yīng)用助力乳腺癌治療
文章題目：Molecular classification of hormone receptor-positive HER2-negative breast cancer
發(fā)表期刊：nature genetics
影響因子：30.8
百趣提供的產(chǎn)品服務(wù)：非靶標(biāo)代謝組+脂質(zhì)組學(xué)
研究背景
乳腺癌是世界上最常見(jiàn)的女性癌癥，分為不同的亞型。目前主要根據(jù)腫瘤的激素受體(hormone receptor, HR)和人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(Human Epidermal GrowthFactor Receptor 2, HER2)的狀態(tài)進(jìn)行治療。其中HR陽(yáng)性/HER2陰性(HR+/HER2-)乳腺癌是最常見(jiàn)的類型，占所有乳腺癌的三分之二。研究表明，使用靶向療法，可以有效改善HR+/HER2-乳腺癌。但靶向藥物和不同生物標(biāo)志物的生物學(xué)相關(guān)性仍然不確定。
對(duì)乳腺腫瘤的分子特征挖掘能夠促進(jìn)臨床治療策略的改善。在臨床試驗(yàn)中，也進(jìn)一步驗(yàn)證了基于乳腺癌亞型的靶向治療的好處。目前，HR+/HER2-乳腺癌的臨床實(shí)踐中已使用了幾種分子模型，但是現(xiàn)有的臨床分期系統(tǒng)或預(yù)后模型不能準(zhǔn)確反映生物學(xué)行為。為了解決這個(gè)問(wèn)題，作者采用DNA和RNA測(cè)序，結(jié)合代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)，專注于開(kāi)發(fā)一種反映HR+/HER2-乳腺癌異質(zhì)性的生物學(xué)特征。此外，作者還通過(guò)深度學(xué)習(xí)開(kāi)發(fā)了卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(convolutional neural network, CNN)模型，幫助從病理全圖像中推斷出乳腺癌亞型。
技術(shù)路線
為了進(jìn)行多組學(xué)亞型分析，作者建立了包含579名患者的中國(guó)HR+/HER2−乳腺癌大規(guī)模多組學(xué)隊(duì)列。隨后，研究了每種亞型的分子特征，并確定了每種亞型特有的治療方法。同時(shí)還設(shè)計(jì)了一種基于人工智能的臨床適用方法來(lái)推斷每種亞型（圖1）。
圖1 研究的簡(jiǎn)要概述
通過(guò)不同維度，使用相似性網(wǎng)絡(luò)融合(Similarity Network Fusion, SNF)（將多組學(xué)數(shù)據(jù)整合起來(lái)，優(yōu)化可視化結(jié)果的一種方法，是一種確定癌癥亞型的有效聚類方法）對(duì)351名具有重疊數(shù)據(jù)集的患者進(jìn)行多組學(xué)聚類（圖1），數(shù)據(jù)表明SNF聚類分析的最佳聚類數(shù)為4，即SNF1-4（經(jīng)典腔面型SNF1, 免疫調(diào)節(jié)型SNF2, 增值型SNF3, RTK驅(qū)動(dòng)型SNF4）（圖2）。
SNF1和SNF3腫瘤幾乎完全由PAM50 luminal A/PAM50 luminal B亞型組成。SNF1 中超過(guò)一半(51%)的腫瘤具有PIK3CA突變，而較少(11%)的腫瘤具有TP53突變（圖2 a）。SNF3腫瘤則表現(xiàn)出更高的CCND1、FGFR1和MDM2拷貝數(shù)增益頻率以及更多的細(xì)胞周期通路激活（圖2 a、b）。在SNF3腫瘤中也觀察到同源重組修回缺陷(homologous recombination deficiency, HRD)，表明基因組的高度不穩(wěn)定性（圖2 a）。
SNF2和SNF4腫瘤含有較少的PAM50 luminal A/PAM50 luminal B亞型和較少的激素受體途徑激活（圖2 b）。SNF2 顯示出豐富的適應(yīng)性免疫反應(yīng)途徑（圖2 b）。對(duì)于SNF4腫瘤，與受體蛋白激酶和細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分相關(guān)的表達(dá)特征高度豐富（圖2 b）。
圖2 HR+ /HER2− 乳腺癌的綜合分析
2 HR+ /HER2− 乳腺癌的代謝組學(xué)分析
作者應(yīng)用歐式距離來(lái)分析SNF亞型及其相應(yīng)正常組織內(nèi)代謝表達(dá)的整體差異。發(fā)現(xiàn)SNF3亞型相比其他亞型代謝失調(diào)程度最高，而SNF4是代謝失調(diào)程度最低的亞型（圖2 c）。這也進(jìn)一步確定不同亞型腫瘤內(nèi)的代謝組學(xué)特征。
隨后通過(guò)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)模型來(lái)探索不同亞型腫瘤中的差異代謝基因、極性代謝物和脂質(zhì)，并說(shuō)明不同亞型之間的代謝特征（圖2 d-f）。結(jié)果顯示大多數(shù)失調(diào)通路在SNF3亞型中上調(diào)，但在SNF4亞型中下調(diào)。此外，SNF1和SNF2亞型以磷脂代謝為特征，并鑒定出參與磷脂合成的基因（例如PIP5K1A15和PIK3CG16）的高表達(dá)。
3 四種SNF 亞型的獨(dú)特臨床特征
作者進(jìn)一步分析了臨床病理特征（圖3 a–d）。通過(guò)免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry, IHC）染色測(cè)量，SNF3腫瘤具有較高的Ki67指數(shù)（在臨床應(yīng)用中，反映Ki-67核蛋白表達(dá)水平的指標(biāo)稱為Ki-67指數(shù)。Ki-67指數(shù)是指所有腫瘤細(xì)胞中免疫組織化學(xué)核染陽(yáng)性的百分率。）和腫瘤分級(jí)，而SNF2腫瘤具有較低的ER表達(dá)（圖3 a–c）。SNF亞型之間的HER2狀態(tài)沒(méi)有顯著差異（圖3 d）。另外，SNF4的無(wú)轉(zhuǎn)移生存率(P = 0.0021)和無(wú)復(fù)發(fā)生存率(P = 0.00093)相比于其他三種亞型較差（圖3 e）。特別是對(duì)于PAM50 luminal A的患者，SNF4的預(yù)后遠(yuǎn)不如其他亞型（圖3 f）。單變量和多變量Cox(proportional hazards model)分析的應(yīng)用明確證實(shí)了SNF4亞型是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)（圖3 g）。總之，作者將HR+/HER2腫瘤重新分類為四種亞型，每種亞型都具有不同的臨床病理和多組學(xué)特征。
圖3 四種SNF亞型的獨(dú)特臨床特征和病理模式
4 臨床適用的SNF亞型分類方法
為了系統(tǒng)的推斷亞型分類，作者使用了兩種分類器，一種基于數(shù)字病理學(xué)數(shù)據(jù)，另一種基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)。
對(duì)于基于數(shù)字病理學(xué)的方法，作者使用了243名患者的全切片圖像以及多組學(xué)SNF亞型結(jié)果，采用基于深度學(xué)習(xí)的流程來(lái)開(kāi)發(fā)CNN模型來(lái)識(shí)別四種亞型中的每一種。結(jié)果顯示，ROC曲線下方的面積大小(Area Under Curve, AUC)SNF1亞型為0.87，SNF2亞型為0.81，SNF3亞型為0.78，SNF4亞型為0.78（圖3 h）�；谖覀冮_(kāi)發(fā)的模型，指示每種SNF亞型的圖塊的形態(tài)特征可總結(jié)如下（圖3 i）：SNF1部分保留正常乳腺的形態(tài)；SNF2高免疫細(xì)胞浸潤(rùn)；SNF3高豐度的非典型腫瘤細(xì)胞；SNF4腫瘤細(xì)胞簇與周圍成纖維細(xì)胞的富集�？傮w而言，這些結(jié)果揭示了 SNF 亞型之間病理模式的差異，并表明基于數(shù)字病理學(xué)區(qū)分SNF亞型的可行性。
對(duì)于基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的方法，作者根據(jù)每個(gè)SNF亞型高表達(dá)基因的數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)了一個(gè)隨機(jī)森林分類器（圖4 a）。在數(shù)字病理學(xué)模型的開(kāi)發(fā)中使用了相同的交叉驗(yàn)證隊(duì)列。結(jié)果顯示：SNF1亞型的AUC為0.95，SNF2亞型為0.93，SNF3亞型為0.85，SNF4亞型為 0.82（圖4 b），高于CNN模型。
圖4 基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的SNF亞型預(yù)測(cè)
5 SNF3 亞型細(xì)胞周期途徑的上調(diào)
通過(guò)基因組分析，作者發(fā)現(xiàn)SNF3樣本中某些細(xì)胞周期基因的拷貝數(shù)變異(copy number alteration, CAN)頻率整體增加（圖5 a）。然后分析這些CNA與RNA或蛋白質(zhì)表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)。觀察到CCND1等癌基因的RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)大幅增加，而RB1等腫瘤抑制基因的表達(dá)減少（圖5 b），表明SNF3基因組改變驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期信號(hào)順式激活（圖5 c）。
通過(guò)G2/M的兩種調(diào)節(jié)因子，也觀察到SNF3中細(xì)胞周期信號(hào)傳導(dǎo)的順式調(diào)節(jié)(cis-regulation)（圖5 e）。此外，HRD和染色體不穩(wěn)定性(chromosome instability, CIN)評(píng)分（圖5 f、g）在SNF3腫瘤中更高。由于高HRD評(píng)分與對(duì)DNA修復(fù)酶抑制劑(poly ADP-ribose polymerase, PARP)的敏感性相關(guān)，作者觀察到來(lái)自SNF3腫瘤的患者的類器官的生長(zhǎng)被單一藥物抑制，并被阿貝昔單抗和奧拉帕尼的組合進(jìn)一步抑制（圖5 h）。這些結(jié)果表明，SNF3亞型富集用于激活G1/S和G2/M細(xì)胞周期進(jìn)程。
圖5 蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示細(xì)胞周期信號(hào)傳導(dǎo)是 SNF3 亞型的靶標(biāo)
6 HR+ /HER2− 乳腺癌的微環(huán)境景觀
腫瘤微環(huán)境(The tumor microenvironment, TME)參與腫瘤的發(fā)展。因此，作者對(duì)四種SNF亞型的微環(huán)境特征進(jìn)行了綜合分析。通過(guò)使用CIBERSORT（利用線性支持向量回歸的原理對(duì)免疫細(xì)胞亞型的表達(dá)矩陣進(jìn)行去卷積，來(lái)估計(jì)免疫細(xì)胞的豐度）和微環(huán)境細(xì)胞群計(jì)數(shù)器的單樣本基因富集分析(Gene Set EnrichmentAnalysis, GSEA)評(píng)估，SNF2腫瘤中免疫細(xì)胞群的豐度顯著增加，特別是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞（圖6 a)。
隨后通過(guò)scRNA-seq進(jìn)一步分析了SNF2和SNF4腫瘤的TME特征。總共分析了來(lái)自9個(gè)腫瘤的69,479個(gè)細(xì)胞，并鑒定了11個(gè)不同的簇（圖6 b）。觀察到 SNF2 樣本中 CD8+T細(xì)胞的比例較高（圖6 c），而SNF4樣本中癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer associated fibroblast, CAF)的比例較高（圖6 d），這驗(yàn)證了批量 RNA-seq 數(shù)據(jù)的反卷積結(jié)果。
另外還發(fā)現(xiàn)，在接受抗程序性死亡配體1(PD-L1)抑制劑治療的手臂中，大多數(shù)SNF2樣本(93％)實(shí)現(xiàn)了病理學(xué)完全緩解（圖6 i）。總體而言，全面剖析了SNF亞型之間的TME異質(zhì)性，并表明SNF2腫瘤以免疫激活狀態(tài)為特征，可能支持對(duì)這些腫瘤使用免疫檢查點(diǎn)阻斷。
圖6 HR+/HER2−乳腺癌的微環(huán)境景觀
7 SNF4 亞型衍生的 CAF 增強(qiáng)腫瘤生長(zhǎng)
通過(guò)RNA-seq、scRNA-seq和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的綜合分析，作者觀察到兩種SNF4高表達(dá)的RTK主要在CAF中表達(dá)并且高度磷酸化（圖7 a）。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡，驗(yàn)證了PDGFRA和EGFR在SNF4腫瘤樣本中高表達(dá)和高磷酸化，特別是在SNF4衍生的CAF中（圖7 b、c）。
此外，作者還觀察到來(lái)自SNF4衍生的CAF的條件培養(yǎng)基可以促進(jìn)SNF1和SNF4衍生的癌細(xì)胞的增殖（圖7 e），表明CAF豐度可能是SNF1和SNF4衍生的癌細(xì)胞侵襲性的機(jī)制之一。
據(jù)報(bào)道，多RTK抑制劑索拉非尼可以有效靶向RAF–MAPK通路，從而抑制EGFR和PDGFRA的激活。通過(guò)癌癥細(xì)胞和CAFs的共培養(yǎng)模型，作者進(jìn)一步驗(yàn)證了索拉非尼治療消除了由SNF4亞型衍生的CAFs共培養(yǎng)誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)表型（圖7 f、g）�？傊�，CAFs中EGFR/PDGFRA的高表達(dá)和下游MAPK信號(hào)通路的激活可能有助于SNF4腫瘤的侵襲性，這也表明了SNF4患者的潛在治療靶點(diǎn)（圖7 h）。
圖7 RTK 驅(qū)動(dòng)(SNF4)亞型衍生的CAF可以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，并且容易受到索拉非尼的影響
總結(jié)
該研究基于大規(guī)模多組學(xué)隊(duì)列，發(fā)現(xiàn)HR+/HER2−癌癥在突變、拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)組、代謝組和病理學(xué)特征方面存在顯著差異。并且通過(guò)分析這些差異性，成功將所有HR+/HER2−群體分為四個(gè)亞型。最后針對(duì)每一個(gè)亞型的異質(zhì)性，進(jìn)一步提出了對(duì)應(yīng)的精確治療方法，為改善精準(zhǔn)醫(yī)療在HR+/HER2−乳腺癌中的應(yīng)用鋪平道路。
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