ChIP-seq等揭示SETD2介導(dǎo)H3K36me3調(diào)控結(jié)直腸癌進展的表觀遺傳機制
結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是一種復(fù)雜的多階段疾病，由基因突變和表觀遺傳改變相互作用引起。組蛋白H3K36三甲基轉(zhuǎn)移酶SET結(jié)構(gòu)域2 (SETD2)是一種表觀遺傳信號分子，在結(jié)直腸癌中突變率為5%。SETD2在氧化偶氮甲烷（Azoxymethane,AOM）/葡聚糖硫酸鈉鹽(Dextran sodium sulfate, DSS)（AOM/DSS）處理的人類結(jié)直腸癌和小鼠發(fā)育中表達降低。SETD2缺失促進了CRC進展，SMAD家族成員4 (SMAD4)在結(jié)直腸癌中的突變率為14%，SMAD4消融導(dǎo)致結(jié)直腸癌。SETD2和SMAD4的共突變可預(yù)測晚期結(jié)直腸癌。然而，對于SETD2和SMAD4的潛在協(xié)同作用知之甚少。
2023年11月14日，上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院李力研究員和同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院魯兵醫(yī)生合作在《Clin Transl Med》雜志發(fā)表題為“Loss of SETD2 aggravates colorectal cancer progression caused by SMAD4 deletion through the RAS/ERK signalling pathway”的研究論文，該研究以小鼠結(jié)直腸癌組織和SW620細胞為研究對象，通過染色質(zhì)免疫共沉淀測序（ChIP-seq）和對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）分析揭示了SETD2缺失通過抑制RAS/ERK信號通路加劇SMAD4缺失引起的結(jié)直腸癌進展。
標題：Loss of SETD2 aggravates colorectal cancer progression caused by SMAD4 deletion through the RAS/ERK signalling pathway（SETD2缺失通過抑制RAS/ERK信號通路加劇SMAD4缺失引起的結(jié)直腸癌進展）
時間：2023-11-14
期刊：Clinical and Translational Medicine
影響因子：IF 10.6
技術(shù)平臺：ChIP-seq、RNA-seq、WB等
研究摘要：
本研究以小鼠結(jié)直腸癌組織和SW620細胞為研究對象，對結(jié)直腸癌患者的臨床數(shù)據(jù)庫進行分析，以研究SETD2與SMAD4的相關(guān)性。研究人員首先構(gòu)建了SETD2和SMAD4雙敲除（double knockdown）小鼠，以進一步研究SETD2在SMAD4缺失型CRC中的作用。分離腸上皮細胞(IECs)進行RNA測序（RNA-seq）和染色質(zhì)免疫沉淀測序(ChIP-seq)，以研究CRC的發(fā)生機制和關(guān)鍵分子。通過分子實驗和細胞實驗分析SETD2在SMAD4缺失型CRC中的作用。最后通過挽救實驗來驗證SETD2在SMAD4缺失型CRC發(fā)生的分子機制。
實驗結(jié)果表明，SETD2缺失促進了SMAD4缺失型CRC的惡性進展。Smad4Vil-KO;Setd2Vil-KO小鼠在經(jīng)AOM/DSS誘導(dǎo)后，表現(xiàn)出更嚴重的CRC表型：腫瘤更大，上皮增殖率更高。進一步的機制研究結(jié)果表明，SETD2缺失導(dǎo)致DUSP7下調(diào)，DUSP7參與抑制RAS/ERK信號通路。最后，ERK1/2抑制劑SCH772984顯著減緩了Smad4Vil-KO;Setd2Vil-KO小鼠的CRC進展，DUSP7過表達顯著抑制了SETD2KO;SMAD4KO 小鼠SW620細胞的增殖率。
本研究結(jié)果表明，SETD2通過促進smad4缺失CRC中DUSP7的轉(zhuǎn)錄來抑制RAS/ERK信號通路，這可能為晚期CRC的治療提供潛在的治療靶點。
圖形摘要
研究結(jié)果：
（1）在晚期CRC中，SETD2和SMAD4共突變率顯著升高
圖2：SETD2缺失促進小鼠SMAD4缺失型CRC的形成。
（A） 免疫熒光和免疫組化方法分析SETD2和SMAD4的表達，Western blot分析SETD2、SMAD4和H3K36me3的表達。比例尺：200μm。數(shù)據(jù)表示平均值±S.D.，通過雙尾Student t檢驗確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。*p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。（B） 誘導(dǎo)小鼠CRC的AOM/DSS方案示意圖。
（C-D） 小鼠腹膜內(nèi)注射10mg/kg AOM后，在飲用水中添加2%DSS喂養(yǎng)小鼠，并記錄體重（C）和生存期（D）的降低（每個基因型n=6）。
（E） AOM注射后90天，處死小鼠以檢查腫瘤負荷和結(jié)腸長度（每個基因型n=6）。比例尺：1cm。
（3）在體內(nèi)和體外實驗中，SETD2沉默加劇了SMAD4缺失型CRC的惡性進展
（C） 各基因型AOM/DSS處理小鼠Ki67和CDX2染色的代表性圖像(每個基因型n=5)。標尺:50 μm(上)，100 μm(下)。數(shù)據(jù)代表平均值±S.D.，統(tǒng)計學(xué)顯著性采用雙尾學(xué)生t檢驗。*,p<0.05;**，p < 0.01;***，p<0.001。
(D-E) 分別用空載體、sgSMAD4質(zhì)粒和sgSETD2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW620細胞，采用實時熒光定量PCR檢測mRNA表達水平(每個基因型n=4)。采用CCK8進行檢測。數(shù)據(jù)代表平均值±S.D.，統(tǒng)計學(xué)顯著性采用雙尾學(xué)生t檢驗。*，p<0.05;***，p<0.001。
（4）SETD2通過激活RAS/ERK信號通路加重SMAD4消融誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌(CRC)
（5）SETD2通過促進RAS/ERK信號通路中的DUSP7轉(zhuǎn)錄來抑制CRC進展
(B) Venn圖顯示Smad4Vil-KO IECs中攜帶H3K36me3結(jié)合并表現(xiàn)出表達變化的基因數(shù)量。右圖顯示重疊基因的KEGG分析。
(C) Smad4Vil-KO小鼠和Smad4Vil-KO;Setd2Vil-KO小鼠中DUSP7表達的RT- qPCR分析。
(D) AOM/DSS處理(10 d) 的Smad4Vil-KO小鼠和Smad4Vil-KO;Setd2Vil-KO小鼠中分離的IECs中DUSP7位點的H3K36me3 ChIP-seq信號快照。
(E) AOM/DSS處理(10 d) Smad4Vil-KO小鼠和Smad4Vil-KO;Setd2Vil-KO小鼠IECs中H3K36me3結(jié)合DUSP7位點的ChIP-qPCR分析，IgG作為對照(每個基因型n=3)。
(F) TCGA數(shù)據(jù)庫中CRC樣本中SETD2和DUSP7表達水平之間的相關(guān)性分析。
(G) RT-qPCR分析轉(zhuǎn)染sgSETD2和sgSMAD4質(zhì)粒的SW620細胞中mRNA的相對表達水平(每個基因型n = 5)。
(H) AOM/DSS處理小鼠DUSP7染色。比例尺:50 μm。數(shù)據(jù)表示平均值±S.D.，通過雙尾Student t檢驗確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。**，p＜0.01；***，p＜0.001。從AOM/DSS處理的小鼠分離的IEC中DUSP7蛋白的Western blot分析。
（6）抑制RAS/ERK信號通路可以延緩癌癥進展
(F） AOM注射 90天后，處死小鼠以檢測腫瘤負荷(每個基因型n = 6)。比例尺:1cm。
(G) AOM/ DSS誘導(dǎo)CRC后，DMSO和SCH772984處理的小鼠腫瘤中顯示Ki67和CDX2染色的代表性圖像(每個基因型n = 5)。標尺:50 μm(上)，100 μm(下)。數(shù)據(jù)代表平均值±S.D.，通過雙尾Student t檢驗確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。*，p < 0.05;**，p < 0.01;***， p<0.001。
(H) DMSO和SCH772984處理小鼠的IECs中與RAS/ERK信號通路相關(guān)的mRNA表達水平(每個基因型n=4)。
(I) 分別用DMSO和SCH772984處理SMAD4KO細胞和SMAD4KO;SETD2KO細胞(每個基因型n=4)。采用CCK8進行檢測。數(shù)據(jù)代表平均值±S.D.，通過雙尾Student t檢驗確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。**，p<0.01。
(J) 分別轉(zhuǎn)染空載體和dup7 OE質(zhì)粒的SW620細胞中DUSP7表達的RT- qPCR分析(每個基因型n=3)。采用CCK8進行檢測。數(shù)據(jù)代表平均值±S.D.，通過雙尾Student t檢驗確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。**，p<0.01;***，p<0.001。
(K) TCGA數(shù)據(jù)庫中CRC樣本中SETD2/ DUSP7與MAPK3表達水平的相關(guān)性分析。
研究意義
SETD2介導(dǎo)的H3K36me3通過促進SMAD4缺失型CRC中DUSP7的轉(zhuǎn)錄來抑制RAS/ERK信號通路，這可能為治療晚期CRC提供潛在的治療靶點。
參考文獻：
Ma C, Liu M, Feng W, Rao H, Zhang W, Liu C, Xu Y, Wang Z, Teng Y, Yang X, Ni L, Xu J, Gao WQ, Lu B, Li L. Loss of SETD2 aggravates colorectal cancer progression caused by SMAD4 deletion through the RAS/ERK signalling pathway. Clin Transl Med. 2023 Nov;13(11):e1475. doi: 10.1002/ctm2.1475. PubMed PMID: 37962020.
2023年11月14日，上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院李力研究員和同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院魯兵醫(yī)生合作在《Clin Transl Med》雜志發(fā)表題為“Loss of SETD2 aggravates colorectal cancer progression caused by SMAD4 deletion through the RAS/ERK signalling pathway”的研究論文，該研究以小鼠結(jié)直腸癌組織和SW620細胞為研究對象，通過染色質(zhì)免疫共沉淀測序（ChIP-seq）和對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）分析揭示了SETD2缺失通過抑制RAS/ERK信號通路加劇SMAD4缺失引起的結(jié)直腸癌進展。
標題：Loss of SETD2 aggravates colorectal cancer progression caused by SMAD4 deletion through the RAS/ERK signalling pathway（SETD2缺失通過抑制RAS/ERK信號通路加劇SMAD4缺失引起的結(jié)直腸癌進展）
期刊：Clinical and Translational Medicine
影響因子：IF 10.6
技術(shù)平臺：ChIP-seq、RNA-seq、WB等
研究摘要：
本研究以小鼠結(jié)直腸癌組織和SW620細胞為研究對象，對結(jié)直腸癌患者的臨床數(shù)據(jù)庫進行分析，以研究SETD2與SMAD4的相關(guān)性。研究人員首先構(gòu)建了SETD2和SMAD4雙敲除（double knockdown）小鼠，以進一步研究SETD2在SMAD4缺失型CRC中的作用。分離腸上皮細胞(IECs)進行RNA測序（RNA-seq）和染色質(zhì)免疫沉淀測序(ChIP-seq)，以研究CRC的發(fā)生機制和關(guān)鍵分子。通過分子實驗和細胞實驗分析SETD2在SMAD4缺失型CRC中的作用。最后通過挽救實驗來驗證SETD2在SMAD4缺失型CRC發(fā)生的分子機制。
實驗結(jié)果表明，SETD2缺失促進了SMAD4缺失型CRC的惡性進展。Smad4Vil-KO;Setd2Vil-KO小鼠在經(jīng)AOM/DSS誘導(dǎo)后，表現(xiàn)出更嚴重的CRC表型：腫瘤更大，上皮增殖率更高。進一步的機制研究結(jié)果表明，SETD2缺失導(dǎo)致DUSP7下調(diào)，DUSP7參與抑制RAS/ERK信號通路。最后，ERK1/2抑制劑SCH772984顯著減緩了Smad4Vil-KO;Setd2Vil-KO小鼠的CRC進展，DUSP7過表達顯著抑制了SETD2KO;SMAD4KO 小鼠SW620細胞的增殖率。
本研究結(jié)果表明，SETD2通過促進smad4缺失CRC中DUSP7的轉(zhuǎn)錄來抑制RAS/ERK信號通路，這可能為晚期CRC的治療提供潛在的治療靶點。
- SETD2缺失促進SMAD4缺失型CRC進展。
- SETD2缺失通過RAS/ERK信號通路加重SMAD4缺失型CRC。
- SETD2通過促進DUSP7轉(zhuǎn)錄抑制RAS/ERK信號通路。
圖形摘要
研究結(jié)果：
（1）在晚期CRC中，SETD2和SMAD4共突變率顯著升高
圖1：晚期結(jié)直腸癌患者中SETD2和SMAD4共突變率升高。
- TCGA數(shù)據(jù)庫中1793例患者樣本中SMAD4和SETD2比例分析。
- TCGA數(shù)據(jù)庫中CRC患者中SMAD4和SETD2 mRNA表達水平相關(guān)性分析。
- 1793例結(jié)直腸癌患者SETD2和SMAD4突變與結(jié)直腸癌分期的比例分析。
- TCGA數(shù)據(jù)庫分析不同癌癥分期與結(jié)直腸癌患者SETD2和SMAD4突變的相關(guān)性。
- TCGA數(shù)據(jù)庫中無突變、SMAD4突變而STED2無突變、SETD2突變而SMAD4無突變、SMAD4和SETD2共突變患者的生存期統(tǒng)計。
圖2：SETD2缺失促進小鼠SMAD4缺失型CRC的形成。
（C-D） 小鼠腹膜內(nèi)注射10mg/kg AOM后，在飲用水中添加2%DSS喂養(yǎng)小鼠，并記錄體重（C）和生存期（D）的降低（每個基因型n=6）。
（E） AOM注射后90天，處死小鼠以檢查腫瘤負荷和結(jié)腸長度（每個基因型n=6）。比例尺：1cm。
（3）在體內(nèi)和體外實驗中，SETD2沉默加劇了SMAD4缺失型CRC的惡性進展
圖3：在體內(nèi)和體外實驗中，SETD2沉默加劇了SMAD4缺失型CRC的惡性進展
(A-B) AOM/DSS處理小鼠結(jié)腸組織的H&E染色切片，各基因型結(jié)腸和腫瘤總體分級的代表性圖像(χ2檢驗)(每個基因型n=5)。比例尺:上200 μm，下100 μm。（C） 各基因型AOM/DSS處理小鼠Ki67和CDX2染色的代表性圖像(每個基因型n=5)。標尺:50 μm(上)，100 μm(下)。數(shù)據(jù)代表平均值±S.D.，統(tǒng)計學(xué)顯著性采用雙尾學(xué)生t檢驗。*,p<0.05;**，p < 0.01;***，p<0.001。
(D-E) 分別用空載體、sgSMAD4質(zhì)粒和sgSETD2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW620細胞，采用實時熒光定量PCR檢測mRNA表達水平(每個基因型n=4)。采用CCK8進行檢測。數(shù)據(jù)代表平均值±S.D.，統(tǒng)計學(xué)顯著性采用雙尾學(xué)生t檢驗。*，p<0.05;***，p<0.001。
（4）SETD2通過激活RAS/ERK信號通路加重SMAD4消融誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌(CRC)
圖4: SETD2通過激活RAS/ERK信號通路加重SMAD4消融誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌。
- 比較AOM/DSS處理10 d小鼠IECs中基因表達的RNA-seq數(shù)據(jù)熱圖。右側(cè)為基因表達變化的KEGG term分析。
- AOM/DSS處理(10 d)小鼠IECs中與代謝通路相關(guān)的mRNA表達水平(每個基因型n=4)。
- SETD2缺失相關(guān)差異表達基因的GSEA富集圖。
- RAS/ERK信號通路相關(guān)基因表達的RNA-seq結(jié)果熱圖。
- AOM/DSS處理(10 d)小鼠IECs中與RAS/ERK信號通路相關(guān)的mRNA表達水平(每個基因型n=4)。
- AOM/DSS處理(10 d)小鼠IECs中目標蛋白的Western blot分析。
- AOM/DSS處理(10 d)小鼠p-p44/p42 MAPK染色。比例尺:100 μm。數(shù)據(jù)代表平均值±S.D.，通過雙尾Student t檢驗確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。**，p＜0.01。
（5）SETD2通過促進RAS/ERK信號通路中的DUSP7轉(zhuǎn)錄來抑制CRC進展
圖5：SETD2通過促進RAS/ERK信號通路中DUSP7轉(zhuǎn)錄來抑制CRC進展。
(A) AOM/DSS處理10 d后的Smad4Vil-KO小鼠IECs中H3K36me3 ChIP-seq信號的歸一化reads密度。H3K36me3 ChIP-seq peaks在基因體和基因間區(qū)域的分布分析。(B) Venn圖顯示Smad4Vil-KO IECs中攜帶H3K36me3結(jié)合并表現(xiàn)出表達變化的基因數(shù)量。右圖顯示重疊基因的KEGG分析。
(C) Smad4Vil-KO小鼠和Smad4Vil-KO;Setd2Vil-KO小鼠中DUSP7表達的RT- qPCR分析。
(D) AOM/DSS處理(10 d) 的Smad4Vil-KO小鼠和Smad4Vil-KO;Setd2Vil-KO小鼠中分離的IECs中DUSP7位點的H3K36me3 ChIP-seq信號快照。
(E) AOM/DSS處理(10 d) Smad4Vil-KO小鼠和Smad4Vil-KO;Setd2Vil-KO小鼠IECs中H3K36me3結(jié)合DUSP7位點的ChIP-qPCR分析，IgG作為對照(每個基因型n=3)。
(F) TCGA數(shù)據(jù)庫中CRC樣本中SETD2和DUSP7表達水平之間的相關(guān)性分析。
(G) RT-qPCR分析轉(zhuǎn)染sgSETD2和sgSMAD4質(zhì)粒的SW620細胞中mRNA的相對表達水平(每個基因型n = 5)。
(H) AOM/DSS處理小鼠DUSP7染色。比例尺:50 μm。數(shù)據(jù)表示平均值±S.D.，通過雙尾Student t檢驗確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。**，p＜0.01；***，p＜0.001。從AOM/DSS處理的小鼠分離的IEC中DUSP7蛋白的Western blot分析。
（6）抑制RAS/ERK信號通路可以延緩癌癥進展
圖6：抑制RAS/ERK信號通路可延緩癌癥進展。
- 處理小鼠結(jié)直腸癌的SCH772984方案示意圖。
- DMSO和SCH772984處理小鼠IECs目標定蛋白的Western blot分析。
- DMSO和SCH772984處理小鼠p-p44/p42 MAPK染色。比例尺:100 μm。數(shù)據(jù)代表平均值±S.D.，通過雙尾Student t檢驗確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。**，p＜0.01。
(F） AOM注射 90天后，處死小鼠以檢測腫瘤負荷(每個基因型n = 6)。比例尺:1cm。
(G) AOM/ DSS誘導(dǎo)CRC后，DMSO和SCH772984處理的小鼠腫瘤中顯示Ki67和CDX2染色的代表性圖像(每個基因型n = 5)。標尺:50 μm(上)，100 μm(下)。數(shù)據(jù)代表平均值±S.D.，通過雙尾Student t檢驗確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。*，p < 0.05;**，p < 0.01;***， p<0.001。
(H) DMSO和SCH772984處理小鼠的IECs中與RAS/ERK信號通路相關(guān)的mRNA表達水平(每個基因型n=4)。
(I) 分別用DMSO和SCH772984處理SMAD4KO細胞和SMAD4KO;SETD2KO細胞(每個基因型n=4)。采用CCK8進行檢測。數(shù)據(jù)代表平均值±S.D.，通過雙尾Student t檢驗確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。**，p<0.01。
(J) 分別轉(zhuǎn)染空載體和dup7 OE質(zhì)粒的SW620細胞中DUSP7表達的RT- qPCR分析(每個基因型n=3)。采用CCK8進行檢測。數(shù)據(jù)代表平均值±S.D.，通過雙尾Student t檢驗確定統(tǒng)計學(xué)顯著性。**，p<0.01;***，p<0.001。
(K) TCGA數(shù)據(jù)庫中CRC樣本中SETD2/ DUSP7與MAPK3表達水平的相關(guān)性分析。
研究意義
SETD2介導(dǎo)的H3K36me3通過促進SMAD4缺失型CRC中DUSP7的轉(zhuǎn)錄來抑制RAS/ERK信號通路，這可能為治療晚期CRC提供潛在的治療靶點。
參考文獻：
Ma C, Liu M, Feng W, Rao H, Zhang W, Liu C, Xu Y, Wang Z, Teng Y, Yang X, Ni L, Xu J, Gao WQ, Lu B, Li L. Loss of SETD2 aggravates colorectal cancer progression caused by SMAD4 deletion through the RAS/ERK signalling pathway. Clin Transl Med. 2023 Nov;13(11):e1475. doi: 10.1002/ctm2.1475. PubMed PMID: 37962020.
標簽：
ChIP-seq
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