活體成像技術(shù)在解決原位移植模型動態(tài)監(jiān)測難題中的應(yīng)用

相較于分批處死動物以獲取實驗數(shù)據(jù)的傳統(tǒng)方法，活體成像技術(shù)利用細(xì)胞和分子水平的定性定量研究進(jìn)行觀測記錄，在構(gòu)建原位成瘤CDX模型相關(guān)研究過程中，更便于跟蹤疾病進(jìn)展及腫瘤轉(zhuǎn)移情況，使得腫瘤模型的動態(tài)監(jiān)測不似以往受限。

賽業(yè)生物在免疫缺陷小鼠上成功移植的人源細(xì)胞系超200種，包括皮下、靜動脈或原位等接種部位，在原位移植方面，已有肺癌、結(jié)腸癌、肝癌等多癌種的成功案例�；�于PE lumina III小動物活體成像等高靈敏度設(shè)備支持，可進(jìn)行CAR-T等細(xì)胞療法藥效學(xué)實驗，以及檢測原位腫瘤模型生長、熒光納米藥物的體內(nèi)分布等。

關(guān)于活體成像技術(shù)

常用于腫瘤活體成像的光學(xué)標(biāo)記方法包括：
1、利用螢火蟲熒光素酶（Firefly Luciferase）或熒光蛋白作為報告基因，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)體外標(biāo)記腫瘤細(xì)胞而直接觀測腫瘤的發(fā)展變化，或標(biāo)記特定基因而研究腫瘤相關(guān)基因在腫瘤發(fā)展中的作用；

2、通過外源注射功能性熒光探針，觀測腫瘤發(fā)展過程中的分子事件，進(jìn)而反映腫瘤的發(fā)展變化。

活體成像在腫瘤研究中的應(yīng)用

宏觀來說，應(yīng)用小動物活體光學(xué)成像技術(shù)進(jìn)行腫瘤研究主要集中于：1、長時間監(jiān)測腫瘤生長及轉(zhuǎn)移；2、抗腫瘤藥物研發(fā)；3、癌癥分子機(jī)理研究。

除藥效學(xué)以外，該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于藥物在體內(nèi)靶向、分布及代謝的研究。此類應(yīng)用是以藥物為直接觀測對象，通常是利用熒光探針直接標(biāo)記藥物本身，通過追蹤熒光信號而反映藥物在體內(nèi)的分布情況。如研究抗體或多肽類藥物能否有效靶向腫瘤時，可利用熒光染料通過化學(xué)鍵的結(jié)合標(biāo)記目標(biāo)抗體或多肽，利用活體光學(xué)成像觀測上述標(biāo)記對象的腫瘤靶向性。

應(yīng)用活體熒光成像技術(shù)進(jìn)行藥物分布的觀測目前主要局限于對生物大分子藥物的研究，而對天然或化學(xué)小分子藥物的分布代謝研究主要依靠的是放射性核素標(biāo)記成像（PET或SPECT），原因是用相對大分子量的熒光染料標(biāo)記小分子藥物，則熒光染料本身即會對小分子藥物在體內(nèi)的分布代謝產(chǎn)生影響，因此無法將活體熒光成像技術(shù)應(yīng)用于此類研究。
 

體內(nèi)外生物發(fā)光實驗梳理

小動物活體成像常用的2種技術(shù)為生物發(fā)光與熒光，其中，生物發(fā)光是用熒光素酶基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，利用其產(chǎn)生的蛋白酶與相應(yīng)的底物熒光素發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生光信號。
 

體外生物發(fā)光

生物發(fā)光試驗熒光素試劑的制備：D-熒光素鈉鹽，配制成100mM的儲存液（200×，濃度30mg/ml），也可以按試驗需要量進(jìn)行配置。將D-Lucirerin溶解于預(yù)熱好的組織培養(yǎng)基中制備成濃度為150μg/ml的工作液。用組織培養(yǎng)基1:200稀釋儲存液，配置工作液（終濃度150μg/mL）。

去除培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至100,000細(xì)胞/ml（10,000細(xì)胞/100μl）。圖像分析前，向細(xì)胞培養(yǎng)板中添加1×熒光素工作液，然后進(jìn)行圖像分析。

*提示：成像前在37℃下對細(xì)胞進(jìn)行短時間孵育可增強(qiáng)信號。

體內(nèi)生物發(fā)光

生物發(fā)光試驗熒光素試劑的制備：用無菌PBS配制D-熒光素鉀鹽工作液（15mg/mL），0.2um濾膜過濾除菌。按10uL/g劑量，給予150mg/kg熒光素工作液（如10g的小鼠注射100μl工作液，給予1.5mg熒光素），腹腔注射熒光素10-15min后進(jìn)行成像。

腹腔注射：左手保定動物，腹部朝上，將動物的顱（頭部）末端朝下。輕輕晃動小鼠2-3次，使腸道中未消化食物向下移動在下腹四分之一部位形成一個空腔。注射點用75%的乙醇消毒。右手持注射器，插入小鼠腹部，注射部位為小鼠后肢根部連線處任一側(cè)1.5cm處，緩慢以45度左右進(jìn)針，進(jìn)針深度小于1cm，進(jìn)針的感受為局部皮膚凹陷消失和落空感。
 

小鼠活體成像實驗要點

對于有毛小鼠，建議在成像實驗的前一天進(jìn)行脫毛，從而最大限度地消除毛發(fā)的背景熒光和其他干擾。小鼠毛發(fā)在短波長激發(fā)光下的背景熒光尤為顯著，如圖1的兩只ICR小鼠（白毛），左為已剃毛，右為未剃毛，在465nm光激發(fā)下，可以明顯看出毛發(fā)的背景熒光。一般建議使用小鼠剃毛器，因為脫毛膏含有一些芳香成分，可能會帶來背景熒光；且脫毛膏和硫化鈉等化學(xué)試劑均可能對小鼠皮膚造成灼傷，傷口處有時會伴隨著較強(qiáng)的背景熒光。
 

小鼠在成像前建議先用溫水浸濕的紗布搽拭口鼻、爪子以及排尿處，因為這些部位常伴隨著不必要的背景熒光。在熒光光譜分離時，有時信號較弱難以識別，可以按照圖2進(jìn)行實驗設(shè)計，即對照組小鼠、受體小鼠和陽性染料對照。
 

活體成像噪音問題

樣品上的背景光

即材料中含有磷光發(fā)光物：問題材料包括塑膠、顏料、有機(jī)物、塑料繩和一些塑料容器；一些污染物，包括動物的尿液也可能是磷光源。
 

來自樣品的背景光

即樣品的天然發(fā)射光，它并不是樣品要被檢測的信號。細(xì)胞培養(yǎng)基可能會產(chǎn)生磷光（材料在使用前，需經(jīng)過成像掃描，以鑒定和排除有問題的材料），這種自身發(fā)射光一直伴隨著活體動物（自發(fā)生物發(fā)光），且存在于體內(nèi)生物發(fā)光成像的主要檢測區(qū)域。大多數(shù)動物表現(xiàn)為較低水平的自發(fā)生物發(fā)光，通常只有在高靈敏度檢測弱信號的時候會存在問題。

背景的近似值（通過檢測相似的對照組動物或者從檢測小鼠的非檢測區(qū)域獲得）可以從ROI測定中去除。

對于體內(nèi)的應(yīng)用，波長范圍最好在600nm以上，低于600nm的光很容易被動物組織吸收掉，這將影響光穿透的深度，如幾個毫米以上深度的熒光基團(tuán)就可能不會被激發(fā)。另外，低于600nm波長，組織的自發(fā)熒光會增加。