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MeRIP-seq等揭示m6A RNA甲基化以ABA依賴性方式調(diào)控草莓果實成熟

瀏覽次數(shù)：458　發(fā)布日期：2023-12-12　 來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)
DNA甲基化等表觀遺傳標(biāo)記在調(diào)控不同成熟階段果實成熟中起著關(guān)鍵作用。m6A甲基化已被證明可以調(diào)控番茄成熟，但目前尚不清楚 mRNA m6A甲基化是否對不同類型水果的成熟調(diào)控具有功能保守性。

2021年6月，中國科學(xué)院植物研究所秦國政研究組在《Genome Biology》雜志發(fā)表題為“N6-methyladenosine RNA modification regulates strawberry fruit ripening in an ABA-dependent manner”的研究論文。 該研究以草莓為研究對象，通過MeRIP-seq和對應(yīng)的RNA-seq等方法揭示了RNA甲基化修飾（m6A）是調(diào)控ABA通路的重要成員，進(jìn)而影響草莓果實成熟。
 

標(biāo)題：N6-methyladenosine RNA modification regulates strawberry fruit ripening in an ABA-dependent manner（N6-甲基腺苷RNA修飾以ABA依賴性方式調(diào)節(jié)草莓果實成熟）
時間：2021-06-03
期刊：Genome Biology
影響因子：IF 12.3/ 1區(qū)
技術(shù)平臺：MeRIP-seq（m6A-seq）、RNA-seq、定量RT-PCR、m6A-IP-qPCR、RIP等
 
研究摘要：
本研究通過MeRIP-seq等分析表明了m6A甲基化在草莓果實成熟過程中是顯著變化。編碼序列（CDS）區(qū)域中的m6A修飾表現(xiàn)出成熟特異性，并靶向穩(wěn)定mRNA，而終止密碼子周圍和3′UTR區(qū)域內(nèi)的m6A修飾通常與相關(guān)mRNA豐度呈負(fù)相關(guān)。研究人員CDS區(qū)域鑒定了數(shù)千個m6A高甲基化轉(zhuǎn)錄本，包括脫落酸（abscisic acid，ABA）生物合成和信號通路中的NCED5、ABAR和AREB1轉(zhuǎn)錄本。本研究證明了甲基轉(zhuǎn)移酶MTA和MTB對于草莓果實的正常成熟必不可少，且MTA介導(dǎo)的m6A修飾促進(jìn)NCED5和AREB1的mRNA穩(wěn)定性，同時促進(jìn)ABAR翻譯。
通過比較不同成熟階段草莓果實的m6A甲基組（m6A methylome），研究人員發(fā)現(xiàn)m6A修飾在草莓果實成熟過程中呈現(xiàn)動態(tài)變化。與番茄果實類似，草莓果實中m6A修飾可富集在終止密碼子和3’ UTR區(qū)域，且與基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。而與番茄果實不同的是，草莓中m6A修飾還可大量富集于CDS區(qū)域，尤其在成熟啟動以后；該區(qū)域的m6A修飾整體上與基因表達(dá)呈正相關(guān)。差異m6A甲基組分析表明，ABA合成基因NCED5及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因ABAR和AREB1的m6A水平在草莓果實成熟過程中顯著升高；m6A修飾可提高NCED5和AREB1的mRNA穩(wěn)定性，并促進(jìn)ABAR的翻譯效率。進(jìn)一步研究顯示，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶MTA和MTB正調(diào)控草莓果實成熟，且MTA在NCED5，ABAR和AREB1的m6A修飾中發(fā)揮重要作用。值得一提的是，在番茄果實中，m6A修飾可調(diào)節(jié)DNA去甲基酶基因的穩(wěn)定性，而在草莓果實中，DNA去甲基酶基因卻不受m6A調(diào)控，說明m6A修飾通過不同的方式影響番茄和草莓果實成熟。
 
研究結(jié)果
（1）m6A甲基化是草莓果實中mRNA的共有表征
圖1：草莓果實中的表觀轉(zhuǎn)錄組m6A甲基化。
  1. 不同發(fā)育階段果實的代表性照片。S6，生長期6；RS1，成熟期1；RS3，成熟期3。比例尺=1cm。
  2. 維恩圖描繪了在果實三個發(fā)育階段的m6A-seq三個生物學(xué)重復(fù)的m6A peaks重疊分析。Rep：重復(fù)。
  3. 樣品中不同m6A peaks值的m6A轉(zhuǎn)錄本百分比


（2）m6A分布在草莓果實成熟起始階段表現(xiàn)出顯著變化
圖2：草莓果實成熟過程中的m6A動態(tài)分布。
  1. 沿轉(zhuǎn)錄本分布的m6A peaks宏基因組圖譜。UTR，非翻譯區(qū)；CDS，編碼序列。紅色箭頭表示成熟過程中與起始密碼子相鄰的CDS區(qū)域中m6A分布變化，綠色箭頭表示終止密碼子周圍或3′UTR內(nèi)m6A分布變化。S6，生長階段6；RS1，成熟階段1；成熟階段3。
b-c. 在四個不重疊的轉(zhuǎn)錄片段中m6A peaks百分比（b）和相對富集度（c）

（3）m6A甲基化總體上影響草莓果實成熟過程中的mRNA豐度

圖3：草莓果實中m6A修飾與mRNA豐度的相關(guān)性分析。
  1. 火山圖顯示與S6期相比，RS1期果實中的高甲基化（紅色）和低甲基化（藍(lán)色）m6A peaks。S6，生長階段6；RS1，成熟階段1。
  2. 火山圖描繪了與RS1期相比，RS3期果實中的高甲基化（紅色）和低甲基化（藍(lán)色）m6A peaks。RS3，成熟階段3。
c-d.  a（c）和b（d）中所示的差異m6A peaks的m6A富集比熱圖。
e.   差異m6A peaks值的分布特征（如a和b所示）。UTR，未翻譯區(qū)；CDS，編碼序列。
f.   火山圖顯示a和b中所示的不同m6A peaks轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)比率。RS3期與RS1期比較，mRNA水平顯著升高和降低的轉(zhuǎn)錄本分別用紅色和藍(lán)色突出顯示（倍數(shù)變化≥1.5；P值< 0.05）。
g-h.  RS1期與S6期果實、RS3與RS1果實的基因表達(dá)變化累積分布（g）和基因表達(dá)比箱形圖（h）。m6A修飾轉(zhuǎn)錄本分為三類：高甲基化、低甲基化和非差異轉(zhuǎn)錄本。
I.    基于RS1和S6階段果實之間的差異m6A peaks分布的基因表達(dá)比箱形圖。星號表示顯著差異（***P< 0.001；Wilcoxon試驗）

（4）ABA生物合成和信號通路中的基因在成熟開始時表現(xiàn)出m6A甲基化差異變化

圖4：m6A修飾促進(jìn)ABA通路中基因的mRNA穩(wěn)定性或翻譯。
  1. 植物中兩個關(guān)鍵ABA信號通路的簡要模型。
  2. 綜合基因組瀏覽器（IGB）軌跡顯示m6A reads在9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙加氧酶5（NCED5）、假定ABA受體（ABAR）和ABA響應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（AREB1）轉(zhuǎn)錄本中的分布。高甲基化m6A peaks（倍數(shù)變化≥1.5；P值< 0.05）通過陰影框表示。S6，生長階段6；RS1，成熟階段1。Rep，重復(fù)。
  3. m6A-seq數(shù)據(jù)中NCED5、ABAR和AREB1的m6A富集分析。
  4. m6A免疫沉淀（IP）-qPCR驗證m6A富集。
e-f.  通過RNA-seq（e）和定量RT-PCR（f）檢測NCED5、ABAR和AREB1的轉(zhuǎn)錄水平。肌動蛋白基因在f中用作內(nèi)部對照。
g.   用于mRNA穩(wěn)定性分析表達(dá)盒的示意圖。將NCED5、ABAR和AREB1基因的野生（WT）或突變（MU）CDS分別克隆到由CaMV 35S啟動子驅(qū)動的pCambia2300載體中。使用定點突變試劑盒將m6A-seq中鑒定并通過SELECT驗證的特異性m6A位點（以紅色突出顯示）從腺苷（A）突變?yōu)轼B嘌呤（G）。
h.   NCED5、ABAR和AREB1的mRNA穩(wěn)定性分析。野生（WT）或突變（MU）CDS在本氏煙草葉片中表達(dá)。在指定的時間點放線菌素D處理后，提取總RNA，并將本氏N.benthamiana ACTIN基因作為內(nèi)部對照進(jìn)行定量RT-PCR分析。
i.   m6A-IP-qPCR分析顯示野生或突變轉(zhuǎn)錄本中的相對m6A富集。
j.   翻譯效率分析的簡要工作流程。
k.   NCED5、ABAR和AREB1的翻譯效率。翻譯效率表示為多體RNA中mRNA相對于總RNA的豐度比。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）。星號表示顯著差異（*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；學(xué)生t檢驗）

（5）草莓果實中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶表征
圖5：m6A甲基轉(zhuǎn)移酶MTA與草莓中的MTB互作。
  1. 哺乳動物中甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體介導(dǎo)的m6A裝置的工作模型。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3和METTL14以異二聚體的形式互作并作為內(nèi)部m6A裝置的穩(wěn)定催化核心。
  2. 真核生物m6A甲基轉(zhuǎn)移酶的系統(tǒng)發(fā)育分析。系統(tǒng)發(fā)育樹由MEGA（5.2版）生成。給出了每個分支1000次重復(fù)的Bootstrap值。物種名稱縮寫如下：Hs, Homo sapiens;  Ms, Mus musculus;  At, Arabidopsis thaliana;  Os, Oryza sativa;  Zm, Zea mays;  Sl, Solanum lycopersicum;  Nb, Nicotiana benthamiana;  Fa, Fragaria × ananassa;  Fve, Fragaria vesca。
  3. RNA-seq揭示了二倍體林地草莓不同發(fā)育階段m6A甲基轉(zhuǎn)移酶基因MTA和MTB的轉(zhuǎn)錄水平。S6，生長階段6；RS1，成熟階段1；成熟階段3。
  4. 不同發(fā)育階段的八倍體栽培草莓果實的代表性圖像。SG，小綠色；Wt，白色；IR，初始紅色；FR，全紅色。比例尺=1cm。
  5. 通過定量RT-PCR分析八倍體草莓果實中MTA和MTB的轉(zhuǎn)錄水平。ACTIN基因被用作內(nèi)部對照。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）。星號表示顯著差異（*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；學(xué)生t檢驗）。
  6. Y2H分析揭示了MTA和MTB之間的互作。與GAL4激活結(jié)構(gòu)域（AD）融合的MTA（AD-MTA）和與GAL4結(jié)合結(jié)構(gòu)域（BD）融合的MTB（BD-MTB）在酵母中共表達(dá)。轉(zhuǎn)化子在SD/-Leu/-Trp（-LW）上生長，并在含有或不含有X-α-gal的SD/-Leu/-Trp/-His（-LWH）和SD/-Leu-Trp/-His/-Ade（-LWHA）上進(jìn)一步篩選。
  7. LCI分析揭示了MTA和MTB之間的互作。與LUC的N末端融合的MTA（MTA nLUC）與MTB或其與LUC C的C末端融合的MT-A70結(jié)構(gòu)域（cLUC MTB或cLUC MTBD）在benthamiana葉片中共表達(dá)。
h-i.  MTA和MTB的亞細(xì)胞定位（h）和共定位（i）。MTA-mCherry或/和MTB-eGFP融合蛋白在N.benthamiana葉片中瞬時表達(dá)。使用表達(dá)eGFP或/和mCherry的N.benthamiana葉片作為陰性對照。比例尺=10 μm

（6）m6A甲基轉(zhuǎn)移酶正調(diào)控草莓果實成熟
圖6：m6A甲基轉(zhuǎn)移酶正調(diào)控草莓果實成熟。
  1. MTA/MTB RNA干擾（RNAi MTA/RNAi MTB）和過表達(dá)（OE-MTA/OE-MTB）果實的成熟表型。用空質(zhì)粒農(nóng)業(yè)滲透的草莓果實作為對照。實驗進(jìn)行三個以上生物學(xué)重復(fù)的，并給出了具有代表性的結(jié)果。比例尺=1 cm。
  2. 通過定量RT-PCR分析RNAi和過表達(dá)果實中MTA和MTB以及兩個重要成熟基因CHS和PG1的轉(zhuǎn)錄水平。ACTIN基因起內(nèi)部對照作用。
  3. LC-MS/MS分析揭示了MTA沉默（RNAi-MTA）或MTA過表達(dá)（OE-MTA）果實中整體m6A甲基化水平變化。
  4. RNA免疫沉淀（RIP）分析揭示了MTA蛋白與NCED5、ABAR和AREB1的轉(zhuǎn)錄本結(jié)合。從表達(dá)MTA-eGFP融合蛋白的草莓果實中提取蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合體，并用抗GFP單克隆抗體或小鼠IgG（陰性對照）進(jìn)行免疫沉淀。
e–h.  在MTA沉默（RNAi MTA）或MTA過表達(dá)（OE-MTA）果實中NCED5、ABAR和AREB1的相對m6A富集（e）、基因表達(dá)（f）、mRNA穩(wěn)定性（g）和翻譯效率（h）變化。通過m6A-IP-qPCR和定量RT-PCR分別分析m6A的相對富集度和基因表達(dá)。在放線菌素D處理后的指定時間點提取總RNA，并進(jìn)行定量RT-PCR分析mRNA穩(wěn)定性。翻譯效率表示為多體RNA中mRNA相對于總RNA的豐度比。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）。星號表示顯著差異（*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001；學(xué)生t檢驗）。NS，不顯著

（7）MTA介導(dǎo)的m6A甲基化調(diào)節(jié)編碼翻譯起始因子和延伸因子的基因

圖7：m6A對草莓翻譯起始因子或延伸因子的影響。
  1. IGB軌跡顯示編碼翻譯起始因子（EIF2、EIF2B、EIF3A和EIF3C）和延伸因子（EF1A）編碼基因轉(zhuǎn)錄本中的m6A reads分布。高甲基化m6A peaks（倍數(shù)變化≥1.5；P值< 0.05）與S6階段的果實的比較分析具有顯著差異。S6，生長階段6；RS1，成熟階段1。Rep，重復(fù)。
  2. m6A-seq數(shù)據(jù)中EIF2、EIF2B、EIF3A、EIF3C和EF1A的m6A富集。
  3. 通過RNA-seq分析EIF2、EIF2B、EIF3A、EIF3C和EF1A的轉(zhuǎn)錄水平。
  4. RNA免疫沉淀（RIP）分析揭示了MTA蛋白與EIF2、EIF2B、EIF3A、EIF3C和EF1A的轉(zhuǎn)錄本結(jié)合。
e–i .  MTA沉默（RNAi MTA）或MTA過表達(dá)（OE-MTA）果實中EIF2、EIF2B、EIF3A、EIF3C和EF1A的相對m6A富集度（e，g）、基因表達(dá)（f，h）和mRNA穩(wěn)定性（i）變化。通過m6A-IP-qPCR和定量RT-PCR分別分析m6A的相對富集度和基因表達(dá)。ACTIN基因為內(nèi)部對照。

（8）MTA在m6A mRNA甲基化過程中發(fā)揮重要作用

圖8：MTA沉默草莓果實中m6A mRNA甲基化組變化。
  1. Venn圖描繪了MTA RNAi（RNAi-MTA）和對照的果實的三個生物學(xué)重復(fù)m6A-seq實驗的m6A peaks重疊分析。
  2. 火山圖顯示與對照組相比，MTA沉默果實中的高甲基化（紅色）和低甲基化（藍(lán)色）m6A peaks。
  3. b中所示的差異m6A peaks的m6A富集比熱圖。
  4. b中所顯示的差異m6A peaks的分布特征。UTR，未翻譯區(qū)；CDS，編碼序列。
e-f.   MTA沉默的果實和對照之間的基因表達(dá)比率（e）和基因表達(dá)變化的累積分布（f）的箱形圖�；赗NA-seq數(shù)據(jù)，分析了與對照相比，MTA沉默果實中低甲基化和非差異性m6A peaks的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)。星號表示顯著差異（***P< 0.001；Wilcoxon試驗）。
g.  與對照相比，MTA沉默果實中低甲基化m6A peaks的轉(zhuǎn)錄本GO富集分析。在agriGO數(shù)據(jù)庫中分析GO富集情況，以及Yekutieli校正P值<0.05

參考文獻(xiàn)：
Zhou L, Tang R, Li X, Tian S, Li B, Qin G. N6-methyladenosine RNA modification regulates strawberry fruit ripening in an ABA-dependent manner. Genome Biol. 2021 Jun 3;22(1):168. pii: 10.1186/s13059-021-02385-0. doi: 10.1186/s13059-021-02385-0. PubMed PMID: 34078442.
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