研究循環(huán)應(yīng)變下NSCs分化：星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元機(jī)械保護(hù)機(jī)制

神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中所有神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源。NSCs 感知位于其特殊細(xì)胞外環(huán)境（稱為神經(jīng)干細(xì)胞生態(tài)位）中的化學(xué)和機(jī)械線索。在這種特殊的微環(huán)境中，NSCs 和祖細(xì)胞由許多調(diào)節(jié)干細(xì)胞特性的細(xì)胞外信號(hào)提供。

由于血液脈動(dòng)，腦組織持續(xù)運(yùn)動(dòng)，組織變形幅度接近高達(dá) 30%。因此，雖然經(jīng)常被忽視，但無(wú)處不在的機(jī)械線索會(huì)影響生態(tài)位，例如周圍微環(huán)境的剛度或或由于微環(huán)境的復(fù)雜結(jié)構(gòu)及其相互連接的細(xì)胞外蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)而產(chǎn)生的管狀結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)。Arumoli 及其同事曾報(bào)告了應(yīng)變作為影響 NSCs 的機(jī)械線索。此外，脈動(dòng)血管施加的機(jī)械應(yīng)變可能會(huì)對(duì) NSCs 產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的影響。研究表明，機(jī)械因素本質(zhì)上影響分化模式和細(xì)胞系定型。然而，關(guān)于循環(huán)應(yīng)變作為 NSCs 命運(yùn)線索的作用知之甚少。

德國(guó) Juelich 研究中心及科隆大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究團(tuán)隊(duì)之前的實(shí)驗(yàn)表明，這種脈動(dòng)運(yùn)動(dòng)可以通過(guò)在可拉伸彈性體上培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)在體外進(jìn)行模擬。使用該系統(tǒng)，循環(huán)拉伸的神經(jīng)元在垂直于單軸應(yīng)變的方向上生長(zhǎng)。這種細(xì)胞重新定向是大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞在拉伸時(shí)的特征反應(yīng)。值得注意的是，循環(huán)拉伸誘導(dǎo)神經(jīng)元分支的生長(zhǎng)，表明機(jī)械應(yīng)變參與了其發(fā)育過(guò)程。在后期的一項(xiàng)研究中，該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步探討了循環(huán)單軸應(yīng)變對(duì)原代大鼠 NSCs 及其后代的影響。相關(guān)研究成果發(fā)表在 Frontiers in Cellular Neuroscience 期刊題為“NSCs Under Strain—Unraveling the Mechanoprotective Role of Differentiating Astrocytes in a Cyclically Stretched Coculture With Differentiating Neurons”。
 

由于遷移細(xì)胞（如NSCs）的高細(xì)胞動(dòng)力學(xué)，研究人員懷疑循環(huán)底物應(yīng)變會(huì)在多大程度上使生長(zhǎng)在彈性體頂部的 NSCs 變形，利用自制的基于交聯(lián)聚二甲基硅氧烷（PDMS）彈性體拉伸系統(tǒng)，腔室以 15% 的振幅和 300 mHz 的頻率單軸拉伸（這種拉伸方案已被證明可以誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)元的明確機(jī)械反應(yīng)）。首先檢測(cè)對(duì)循環(huán)應(yīng)變的即時(shí)反應(yīng)，通過(guò)活細(xì)胞顯微鏡觀察 NSCs 的機(jī)械變形。振幅逐步增加 4%，直到應(yīng)變的 28%，并在釋放位置再次成像（圖1 A）。底物應(yīng)變使神經(jīng)元胞體細(xì)胞和 NSCs 的突起均發(fā)生變形，而且沿著拉伸方向排列的細(xì)胞過(guò)程跟隨底物拉伸（圖1 B），而垂直于拉伸方向的細(xì)胞過(guò)程沒(méi)有發(fā)生明顯的伸長(zhǎng)。在施加28%的底物應(yīng)變后，NSCs 顯示細(xì)胞體拉伸 25.5%（圖1 C）。NSCs 不會(huì)受到底物變形的負(fù)面影響，因?yàn)楦鶕?jù)碘化丙啶評(píng)估它們不會(huì)收縮并且保持活力（圖1 D、E）。

圖1 NSCs遵循底物變形，不受循環(huán)應(yīng)變的影響。

接下來(lái)，研究了循環(huán)機(jī)械應(yīng)變對(duì) NSCs 特征功能的影響，即增殖，分化和譜系決定（lineage commitment）。與未拉伸對(duì)照相比，在有絲分裂原 FGF 存在下循環(huán)拉伸24小時(shí)顯著降低了 NSC 的增殖率。然而，有絲分裂原停用后5天開(kāi)始分化的譜系決定并沒(méi)有被整個(gè)時(shí)間內(nèi)應(yīng)用的循環(huán)機(jī)械拉伸所改變。此外，用干性標(biāo)記物 Sox2 染色證明，有絲分裂原停用5天后的循環(huán)拉伸不影響仍未分化的 NSCs 的百分比，這表明這種機(jī)械刺激既不影響 NSC 分化的速度，也不影響 NSC 分化的命運(yùn)。

雖然大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞大致垂直于單軸循環(huán)應(yīng)變排列以減少其機(jī)械應(yīng)力，但在這里首次發(fā)現(xiàn) NSCs 平行于拉伸方向排列（圖2 A-C）。NSCs 的細(xì)胞骨架絲在細(xì)胞內(nèi)具有不同的空間分布，導(dǎo)致其對(duì)應(yīng)變有明顯的重定向模式（圖2 B）。然而，肌動(dòng)蛋白更多地定位于外周部分和細(xì)胞突起，只有適度的重新排列。有趣的是，實(shí)驗(yàn)沒(méi)有觀察到任何應(yīng)力纖維的形成，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架分布在拉伸組和對(duì)照組中相似�？偟膩�(lái)說(shuō)，細(xì)胞骨架標(biāo)記在暴露于循環(huán)拉伸24小時(shí)后顯示出平行于應(yīng)變的重新定向（圖2 C）。通過(guò)半定量分析，發(fā)現(xiàn)拉伸 NSC 中微管蛋白和巢蛋白染色的圖像強(qiáng)度增加，這表明拉伸誘導(dǎo)了兩個(gè)細(xì)胞骨架系統(tǒng)的細(xì)胞骨架增強(qiáng)（圖2 D）。
 

圖2 神經(jīng)干細(xì)胞在應(yīng)變和細(xì)胞骨架重分布下的重定向。

由于 NSCs 在拉伸方向上重新定向，因此接著研究了 NSCs 在分裂原退出誘導(dǎo)的分化過(guò)程中如何對(duì)應(yīng)變作出反應(yīng)。與未分化的 NSC 類似，NSC 衍生的年輕星形膠質(zhì)細(xì)胞平行于循環(huán)應(yīng)變排列。在分化過(guò)程中拉伸的星形膠質(zhì)細(xì)胞與未拉伸的對(duì)照細(xì)胞相比，GFAP（膠質(zhì)纖維酸性蛋白）排列明顯向應(yīng)變方向轉(zhuǎn)移。相比之下，NSC 衍生的年輕神經(jīng)元沒(méi)有顯示出任何重新定向。

為了研究這種重新定向行為是否是星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的一個(gè)主動(dòng)的、持續(xù)的過(guò)程，在拉伸3天后將單軸應(yīng)變的方向旋轉(zhuǎn)90°，這是一個(gè)已經(jīng)可以看到定向生長(zhǎng)的時(shí)間點(diǎn)。旋轉(zhuǎn)人為地迫使星形膠質(zhì)細(xì)胞向遠(yuǎn)離拉伸的方向運(yùn)動(dòng)。然而，持續(xù)2天的循環(huán)拉伸恢復(fù)了星形膠質(zhì)細(xì)胞的平行方向，強(qiáng)調(diào)了應(yīng)變方向的排列特征是年輕星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)循環(huán)應(yīng)變的穩(wěn)定和積極的機(jī)械反應(yīng)。這表明，神經(jīng)干細(xì)胞分化過(guò)程中的循環(huán)應(yīng)變?cè)谏窠?jīng)表型缺乏機(jī)械反應(yīng)的情況下使星形膠質(zhì)細(xì)胞向拉伸方向重新定向。

細(xì)胞與應(yīng)變的平行排列先前被描述為依賴于 GTPase RhoA 的激活，并且與內(nèi)皮細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞中缺乏應(yīng)力纖維有關(guān)。由于觀察到 NSCs 中缺乏中心應(yīng)力纖維，因此假設(shè) NSCs 中缺乏收縮性可能是導(dǎo)致這些細(xì)胞在最大機(jī)械負(fù)荷方向排列的原因。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，通過(guò)溶血磷脂酸（LPA）激活 RhoA 來(lái)增加 NSCs 的收縮性，并觀察到 NSCs 中中心應(yīng)力纖維的清晰形成與應(yīng)變無(wú)關(guān)。此外，在拉伸應(yīng)用后，應(yīng)力纖維誘導(dǎo)顯著降低了 NSCs 在最大機(jī)械負(fù)荷方向的定向行為，從而降低了之前發(fā)現(xiàn)的 NSCs 的機(jī)械響應(yīng)。

相反，應(yīng)力纖維存在于產(chǎn)后星形膠質(zhì)細(xì)胞中。與未拉伸的細(xì)胞相比，拉伸后在垂直方向上可以檢測(cè)到輕微的重新定向，值得注意的是，星形膠質(zhì)細(xì)胞的 GFAP 細(xì)胞骨架不受循環(huán)拉伸的影響。在24小時(shí)的拉伸后，它沒(méi)有顯示出任何定向方向，導(dǎo)致出生后星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分布的長(zhǎng)細(xì)胞形狀。

為了進(jìn)一步闡明星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元之間以及分化階段觀察到的差異，最后，進(jìn)一步評(píng)估了星形膠質(zhì)細(xì)胞/神經(jīng)元共培養(yǎng)中不同細(xì)胞比例對(duì)循環(huán)應(yīng)變的反應(yīng)（圖3 A、B）。雖然分離的神經(jīng)元與應(yīng)變垂直排列（圖3 B、C），但共培養(yǎng)中神經(jīng)元的重新排列取決于星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例（圖3 B）。隨著星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增加，在相同數(shù)量的星形膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)（1：1），神經(jīng)元的排列不斷減少，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的隨機(jī)定向。然而，當(dāng)共培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞較少時(shí)（4：1），神經(jīng)元細(xì)胞保持其機(jī)械反應(yīng)，相對(duì)于應(yīng)變保持垂直方向排列。共聚焦顯微鏡和3D重建顯示，混合培養(yǎng)中皮層神經(jīng)元在產(chǎn)后星形膠質(zhì)細(xì)胞上生長(zhǎng)（圖3 D）。這些數(shù)據(jù)不僅證實(shí)了之前顯示的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元分化的協(xié)同細(xì)胞生長(zhǎng)，而且還證明了星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)分化的神經(jīng)元具有機(jī)械保護(hù)功能。

實(shí)驗(yàn)在 LPA 存在下的神經(jīng)元拉伸實(shí)驗(yàn)以及神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)中進(jìn)一步分析了這一假設(shè)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了純神經(jīng)元相對(duì)于拉伸在垂直方向上的重新定向。有趣的是，即使 RhoA 被激活，星形膠質(zhì)細(xì)胞以1-1的比例存在也保留了它們對(duì)神經(jīng)元的機(jī)械保護(hù)作用。如果 RhoA 在整個(gè)24小時(shí)的拉伸時(shí)間內(nèi)或僅在拉伸的最后40分鐘被激活，這種效果保持穩(wěn)定。
 

圖3 產(chǎn)后星形膠質(zhì)細(xì)胞的機(jī)械保護(hù)作用。

總之，這些發(fā)現(xiàn)可能突出了星形膠質(zhì)細(xì)胞在清除對(duì)神經(jīng)元表型的機(jī)械影響方面的重要作用及其提出的機(jī)械保護(hù)功能。這種機(jī)制保護(hù)與星形膠質(zhì)細(xì)胞支持、引導(dǎo)和促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)的作用相吻合。此外，星形膠質(zhì)細(xì)胞與血管密切相互作用，甚至調(diào)節(jié)血流和血管直徑，從而可能緩沖腦血管系統(tǒng)的機(jī)械負(fù)荷。該研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了機(jī)械力對(duì)發(fā)育和成體階段基本腦細(xì)胞特性的重要性，并深入了解了神經(jīng)源性生態(tài)位中 NSCs 行為的復(fù)雜但未知的機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：Abraham JA, Blaschke S, Tarazi S, Dreissen G, Vay SU, Schroeter M, Fink GR, Merkel R, Rueger MA, Hoffmann B. NSCs Under Strain-Unraveling the Mechanoprotective Role of Differentiating Astrocytes in a Cyclically Stretched Coculture With Differentiating Neurons. Front Cell Neurosci. 2021 Sep 24;15:706585. doi: 10.3389/fncel.2021.706585. PMID: 34630042; PMCID: PMC8497758.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34630042/

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