通過機(jī)械或藥物刺激激活 TRPV4 阻斷 IL-1β介導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)破壞

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是最常見的慢性關(guān)節(jié)疾病。軟骨的健康是通過對機(jī)械刺激的響應(yīng)來維持的，壓縮或拉伸應(yīng)變形式的機(jī)械負(fù)荷在軟骨細(xì)胞中具有抗炎作用，并阻斷促炎介質(zhì)一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）的釋放，以響應(yīng)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）。炎癥信號傳導(dǎo)導(dǎo)致OA中的軟骨退化，因此了解機(jī)械負(fù)荷與炎癥之間的聯(lián)系會對治療產(chǎn)生重大的影響。

瞬時感受器電位離子通道香草素受體4（TRPV4）是一種Ca²⁺ 可滲透的非選擇性陽離子通道，在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中高度表達(dá)，并被機(jī)械刺激激活。TRPV4 是軟骨細(xì)胞和其他細(xì)胞類型機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的，它介導(dǎo)促合成代謝和抗分解代謝基因的調(diào)控，促進(jìn)軟骨中細(xì)胞的增殖和基質(zhì)的產(chǎn)生，而這兩者都會影響關(guān)節(jié)的生長。TRPV4 定位于質(zhì)膜和初級纖毛。初級纖毛參與了軟骨細(xì)胞機(jī)械傳導(dǎo)和炎癥信號傳導(dǎo)。研究已經(jīng)報道了機(jī)械負(fù)荷通過與鞭毛內(nèi)運(yùn)輸（IFT）/纖毛改變相關(guān)的組蛋白脫乙�；�酶6（HDAC6）激活與來抵消炎癥信號，以響應(yīng)促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）。TRPV4 在該途徑中的作用尚未確定。

基于此，在英國倫敦瑪麗女王大學(xué)工程與材料科學(xué)學(xué)院研究團(tuán)隊的一項實驗中，首次證明了通過循環(huán)拉伸應(yīng)變（CTS）、低滲透刺激或 TRPV4 選擇性激活劑GSK1016790A 激活 TRPV4 可抑制促炎性 IL-1β 信號傳導(dǎo)和與初級纖毛伸長改變相關(guān)的軟骨降解。因此，TRPV4 可能為治療關(guān)節(jié)疾病和其他炎癥病變提供新的靶點。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在Osteoarthritis AND Cartilage 期刊題為“Activation of TRPV4 by mechanical, osmotic or pharmaceutical stimulation is anti-inflammatory blocking IL-1β mediated articular cartilage matrix destruction”。

首先，IL-1β 處理（1-10 ng/ml濃度，24h）導(dǎo)致 NO 和 PGE2 的顯著劑量依賴性釋放，而CTS（0.33 Hz，0-10% 應(yīng)變，24 h）形式的機(jī)械載荷顯著降低了這種反應(yīng)。IL-1β誘導(dǎo)的NO釋放被CTS消除，因此1或10 ng/ml均無統(tǒng)計學(xué)意義，CTS在1 ng/ml IL-1β濃度下完全抑制PGE2的釋放，但在10 ng/ml濃度下僅部分抑制PGE2的釋放。用TRPV4拮抗劑GSK205（10μM）同時處理可消除機(jī)械負(fù)荷的抗炎作用。此外，GSK205 在有或沒有 IL-1β 的無負(fù)載細(xì)胞中對 NO 或 PGE2 釋放沒有影響，但在有 IL-1β 的負(fù)載細(xì)胞中 IL-1β 效應(yīng)可被恢復(fù)，NO 和PGE2 釋放均被IL-1β顯著提高。無論是否存在 CTS，IL-1β 和 GSK205 處理均不影響 TRPV4 蛋白水平。這些數(shù)據(jù)表明，機(jī)械負(fù)荷的抗炎作用是由 TRPV4 激活介導(dǎo)的。

接下來，實驗將分離的軟骨細(xì)胞用高滲透壓培養(yǎng)基（400 mOsm）、低滲透壓培養(yǎng)基（200 mOsm）或等滲透壓培養(yǎng)基（315 mOsm）處理24小時（圖1 A、B）。結(jié)果表明，無論是否存在IL-1β ，與等滲對照相比，高滲透刺激對NO釋放沒有顯著影響，而低滲透刺激顯著減弱了IL-1β（1 ng/ml）的促炎反應(yīng)，使得24 h時NO釋放的增加顯著降低（圖1 A），但對細(xì)胞活力沒有明顯影響（圖1 B）。在GSK205存在下，完全抑制了低滲透刺激對IL-1β誘導(dǎo)的NO釋放的抗炎作用，使得NO釋放的效果與對照條件沒有顯著差異（圖1 A）。

在軟骨外植體中，低滲透刺激顯著降低了 IL-1β 誘導(dǎo)的 NO 釋放（圖1 C），而且阻斷了IL-1β介導(dǎo)的sGAG釋放，表明細(xì)胞外基質(zhì)降解減少。在整個實驗過程中，軟骨細(xì)胞活力保持不變（圖1 D）。與分離的細(xì)胞一致，在存在或不存在 1 ng/ml IL-1β 的情況下，高滲透刺激對 NO 或 sGAG 釋放沒有影響。GSK205 處理恢復(fù)了低滲透介質(zhì)中 IL-1β 誘導(dǎo)的 NO 釋放從而阻斷滲透激發(fā)的抗炎作用（圖1 C）。有趣的是，GSK205 進(jìn)一步增加了 IL-1β 誘導(dǎo)的 NO 在等滲對照培養(yǎng)基中的釋放，這在分離細(xì)胞中未見（圖1 C）。這些數(shù)據(jù)共同表明，低滲透壓負(fù)荷的抗炎作用也是由 TRPV4 激活介導(dǎo)的。

圖1 低滲透刺激在分離的軟骨細(xì)胞和軟骨外植體中通過 TRPV4 依賴性途徑抑制 IL-1β 介導(dǎo)的 NO 釋放。

IL-1β 誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的初級纖毛伸長，并通過調(diào)節(jié) IFT 介導(dǎo)下游分解代謝 NF-κB 信號傳導(dǎo)。因此，實驗研究了初級纖毛在TRPV4激活的抗炎機(jī)制中的參與。在分離的軟骨細(xì)胞中觀察到 TRPV4 纖毛定位，通過機(jī)械負(fù)荷、低滲透刺激或GSK101（1 nM）激活 TRPV4 會增加 TRPV4 纖毛定位，但對蛋白質(zhì)表達(dá)沒有顯著影響。這些數(shù)據(jù)提示了 IFT 的改變。

在分離的軟骨細(xì)胞中，IL-1β（1ng / ml）處理24h可誘導(dǎo)初級纖毛長度從中位數(shù)2.21-2.84 μm顯著增加，而GSK101 激活 TRPV4 而消除這種效應(yīng)。IL-1β介導(dǎo)的纖毛伸長也被機(jī)械負(fù)荷（CTS，0-10%，0.33 Hz） 和低滲透刺激阻斷。GSK205抑制TRPV4恢復(fù)了IL-1β介導(dǎo)的纖毛在機(jī)械負(fù)荷和低滲透刺激下的伸長。這些數(shù)據(jù)表明，TRPV4激活與初級纖毛定位改變有關(guān)并調(diào)節(jié)纖毛長度。

然后，實驗研究了 TRPV4 的直接藥物激活是否會復(fù)制機(jī)械和滲透負(fù)荷的抗炎作用。IL-1β （1 ng/ml）誘導(dǎo)離體軟骨細(xì)胞中NO和PGE2釋放的特征性上調(diào)，而GSK101可以消除這種上調(diào)（圖2 A、B）。同樣，IL-1β 誘導(dǎo)的 COX2 表達(dá)被 GSK101 消除（圖2 C）。

此前，已經(jīng)確定了 HDAC6 激活和轉(zhuǎn)錄后微管蛋白修飾在機(jī)械負(fù)荷抗炎作用中的機(jī)制作用。同樣，GSK101 導(dǎo)致 HDAC6 活性顯著上調(diào)（圖2 D），表明 TRPV4 介導(dǎo)的鈣信號激活 HDAC6。與這一發(fā)現(xiàn)一致，實驗觀察到顯著的微管蛋白去乙�；�，伴隨著非聚合的可溶性微管蛋白池的減少（圖2 E-F）。此外，HDAC6 特異性抑制劑 Tubacin（500 nM）恢復(fù)了 IL-1β 介導(dǎo)的 GSK101 處理細(xì)胞中 NO 的釋放（圖2 G）。這些數(shù)據(jù)表明，GSK101 模擬了機(jī)械負(fù)荷對 IL-1β 炎癥信號傳導(dǎo)、HDAC6 激活和微管蛋白修飾的影響。

圖2 TRPV4 激活通過 HDAC6 激活消除 IL-1β 炎癥信號傳導(dǎo)。

最后，實驗確定了TRPV4的藥物激活是否可以防止軟骨退化和機(jī)械性能的喪失，將軟骨外植體在1nM或10nM GSK101存在下用IL-1β處理12天。在IL-1β處理下，觀察到顯著的NO釋放（圖3 A），表明炎癥信號的激活。這種反應(yīng)伴隨隨顯著的 sGAG 釋放，表明軟骨退化（圖3 B）。

然后使用單軸無側(cè)限壓縮測量軟骨組織的粘彈性，以確定 GSK101 是否可以防止 IL-1β 引起的機(jī)械性能喪失。軟骨外植體呈現(xiàn)出以切線模量為15-20 MPa的非線性應(yīng)力-應(yīng)變曲線（圖3 C）。隨后在20% 應(yīng)變下粘彈性應(yīng)力松弛（圖3 D），在300秒下松弛模量為2-3 MPa，代表80%的松弛，松弛半衰期約為50秒（圖3 E-H）。IL-1β處理導(dǎo)致機(jī)械剛度急劇下降，如切線模量（圖3 E）和松弛模量（圖3 F）的顯著降低，松弛百分比增加（圖3 G）和半衰期減少（圖3 H）。

GSK10顯著抑制IL-1β處理后軟骨外植體NO的累積釋放（圖3 A）。同樣，sGAG的累積釋放也顯著減少，并且響應(yīng)IL-1β的機(jī)械性能喪失被消除，因此在有和沒有IL-1β的情況下，任何生物力學(xué)參數(shù)都沒有顯著差異。這些數(shù)據(jù)表明，TRPV4 激活消除了 IL-1β 介導(dǎo)的軟骨退化和機(jī)械性能喪失。

圖3 TRPV4 激活抑制 IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨外植體中 NO 釋放、基質(zhì)降解和機(jī)械性能喪失。

總之，該研究證明了 TRPV4 激活在負(fù)荷下的抗炎機(jī)制中的作用。除了為該通路提供新的機(jī)制理解外，該研究還將 TRPV4 確定為潛在的治療靶點，并證明該蛋白的藥物激活可以調(diào)節(jié)炎癥和其他涉及軟骨疾病的 IFT 依賴性通路。

參考文獻(xiàn)：Fu S, Meng H, Inamdar S, Das B, Gupta H, Wang W, Thompson CL, Knight MM. Activation of TRPV4 by mechanical, osmotic or pharmaceutical stimulation is anti-inflammatory blocking IL-1β mediated articular cartilage matrix destruction. Osteoarthritis Cartilage. 2021 Jan;29(1):89-99. doi: 10.1016/j.joca.2020.08.002. PMID: 33395574; PMCID: PMC7799379.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33395574/

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