納米抗體發(fā)現(xiàn)的酵母展示平臺(tái)原理及應(yīng)用

1.什么是酵母展示平臺(tái)

酵母展示（或酵母表面展示）是一種強(qiáng)大的蛋白質(zhì)工程技術(shù)，它是用整合到酵母細(xì)胞壁中的重組蛋白的表達(dá)來分離和工程化抗體。自 2000 年首次發(fā)表以來，酵母表面展示已被廣泛用于設(shè)計(jì)各種蛋白質(zhì)以提高親和力、特異性、表達(dá)、穩(wěn)定性和催化活性。

 

2.酵母展示原理

酵母抗體展示技術(shù)（Yeast Display Technology）是指用抗體序列可變區(qū)與凝集素Aga2p融合表達(dá)，Aga2p蛋白亞基通過兩個(gè)二硫鍵與固定在酵母細(xì)胞壁上的Aga1p 蛋白亞基結(jié)合，結(jié)合流式分選技術(shù)，將靶向抗原的特異性抗體給篩選出來。

 

圖1：酵母文庫展示示意圖

3.納米抗體

納米抗體（Nanobody, Nbs）是駝科動(dòng)物外周血清產(chǎn)生的一種單鏈抗體，這些抗體僅由重鏈組成，缺乏輕鏈和功能性CH1和CH4結(jié)構(gòu)域。VHH晶體為2.5nm，長4nm，分子量只有15KDa。相較于傳統(tǒng)抗體，納米抗體因其分子量小，從而更容易可穿透血腦屏障；原核或真核系統(tǒng)有高表達(dá)量；特異性強(qiáng)，親和力高；對人的免疫原性弱等優(yōu)點(diǎn)，因此在抗腫瘤藥物研發(fā)、心腦血管疾病、免疫疾病等領(lǐng)域有巨大價(jià)值。

 

圖2：納米抗體的3D結(jié)構(gòu)

 

4.納米抗體酵母展示優(yōu)缺點(diǎn)

4.1優(yōu)點(diǎn)

（1）酵母作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可以進(jìn)行翻譯后修飾來表達(dá)和折疊復(fù)雜的真核蛋白；

（2)）相對噬菌體展示文庫技術(shù)而言，酵母展示技術(shù)在微量抗體表達(dá)后抗體活性要高，得益此基礎(chǔ)，在流式篩選時(shí)就能區(qū)分抗體的親和力高低；

（3）插入異源蛋白不會(huì)破壞表面蛋白的結(jié)構(gòu)，也不會(huì)影響表面展示的效率。

4.2缺點(diǎn)

（1）相比于噬菌體展示技術(shù)，酵母展示庫容量較低，因此主要應(yīng)用于客戶對項(xiàng)目庫容要求不高，動(dòng)物免疫后PBMC細(xì)胞經(jīng)過二次分選以及避免漏掉二硫鍵形成的抗體發(fā)現(xiàn)項(xiàng)目；

（2）由于酵母表面存在多個(gè)蛋白質(zhì)拷貝，可能會(huì)發(fā)生與寡聚蛋白靶標(biāo)不希望的多價(jià)結(jié)合。

 

5.酵母抗體展示應(yīng)用

隨著這項(xiàng)技術(shù)的不斷完善，現(xiàn)在酵母展示的應(yīng)用包括酶工程；蛋白質(zhì)表位作圖、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的鑒定、免疫生物催化和生物傳感器，以及用于生物技術(shù)和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的酵母細(xì)胞上蛋白質(zhì)和酶的展示。

 

6.泰克生物酵母抗體技術(shù)服務(wù)展示

納米抗體酵母展示服務(wù)主要流程如下：抗原準(zhǔn)備，羊駝免疫，PBMC分離，RNA提取，cDNA制備，文庫構(gòu)建，文庫篩選，抗體表達(dá)。

 

圖3：酵母抗體展示文庫流程圖

5.1抗原制備

5.1.1密碼子優(yōu)化+基因模板合成+表達(dá)載體構(gòu)建；

5.1.2質(zhì)粒抽提+轉(zhuǎn)染（哺乳表達(dá)系統(tǒng)）目的蛋白檢測（WB，SDS-PAGE）；

5.1.3蛋白表達(dá)放大+蛋白親和純化。

5.2動(dòng)物免疫

5.2.1動(dòng)物免疫4次，加強(qiáng)免疫一針，共計(jì)免疫5針；

5.2.2免疫前采集陰性血清，第4針采血進(jìn)行ELISA檢測血清效價(jià)；

5.2.3若第4針血清抗體效價(jià)（蛋白抗原>10⁵；多肽抗原>10⁴）滿足要求，則采血前7天再次加強(qiáng)免疫1針，如不滿足要求，則繼續(xù)常規(guī)免疫；

5.2.4效價(jià)合格，采血（＞100ml）分離單核細(xì)胞。

5.3 cDNA制備

5.3.1 PBMC總RNA提取（參照RNA提取試劑盒）；

5.3.2高保真RT-PCR制備cDNA（參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒）。

5.4文庫制備

5.4.1以cDNA為模板，兩輪PCR擴(kuò)增VHH基因；

5.4.2酵母表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)化： VHH基因拼接酵母展示載體，電擊轉(zhuǎn)化酵母宿主菌，構(gòu)建抗體庫，電擊次數(shù)不低于10次；

5.4.3鑒定：隨機(jī)挑選24個(gè)克隆，PCR鑒定陽性率+PCR鑒定多樣性+插入率。

 

圖4：VHH陽性率:>90%

 

5.5文庫篩選

5.5.1磁珠分選；

5.5.2 FACS分選（免疫雙標(biāo)分選）；

5.5.3鋪板+陽性克隆菌培養(yǎng)+抗體基因測序；（>20個(gè)，多達(dá)96個(gè)）。

 

5.6抗體表達(dá)

5.6.1將獲得的抗體序列構(gòu)建合適的表達(dá)載體（哺乳表達(dá)）進(jìn)行表達(dá)+親和純化+抗體蛋白定量；

 

圖5：Fc-VHH納米抗體表達(dá)結(jié)果圖片

 

5.6.2 Elisa驗(yàn)證抗體與抗原結(jié)合，進(jìn)行下游驗(yàn)證（交付EC50數(shù)據(jù)）;

5.6.3 BLI法驗(yàn)證抗體親和力；

5.6.4細(xì)胞功能驗(yàn)證：流式驗(yàn)證；

5.6.5驗(yàn)證細(xì)胞系（抗原受體過表達(dá)細(xì)胞系）。

 

7.酵母展示服務(wù)優(yōu)勢

（1）物種適應(yīng)性廣泛：人，鼠，兔，羊，羊駝，駱駝，魚等物種的單抗開發(fā)均兼容

（2）技術(shù)平臺(tái)成熟：提供的1級免疫文庫的建庫庫容為10⁶-10⁷；插入率均滿足>95%，篩選獲得的抗體親和力普遍處于nM-pM級別

（3）開發(fā)周期短：獲得PBMC后，建庫到篩選獲得抗體序列，3-4周

（4）產(chǎn)品交付標(biāo)準(zhǔn)高：針對免疫庫，交付免疫前后血清，抗體展示文庫，酵母表達(dá)菌株，抗體序列

 

隨著抗體庫技術(shù)的不斷發(fā)展，噬菌體展示抗體文庫已經(jīng)生產(chǎn)了大量的高活性抗體，噬菌體展示技術(shù)的廣泛應(yīng)用促使科學(xué)家對于酵母文庫技術(shù)的不斷探索。酵母展示技術(shù)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，相比于噬菌體展示系統(tǒng)有其獨(dú)特的優(yōu)勢，因此在人類治療和診斷領(lǐng)域也占據(jù)著重要地位。