scRNA‑seq圖譜在揭示浸潤性5ALA代謝細胞的獨特分子特征中的應(yīng)用

Fig1. 空間差異GBM區(qū)域差異基因表達分析

2. 5ALA + GBM人群富含間充質(zhì)亞型、炎癥傷口反應(yīng)轉(zhuǎn)錄程序和糖酵解代謝狀態(tài)
為了驗證5ALA +細胞群類似于特定GBM亞型的假設(shè)，利用富集分析來鑒定先前由Verhaak等人描述的GBM分子亞型(經(jīng)典(CL)、神經(jīng)(NE)、原膜(PN)和間質(zhì)(MES)。與其他區(qū)域相比，核心和邊緣區(qū)域主要富集CL和PN亞型，特別是5ALA +細胞，而最近修訂的非腫瘤性NE亞型在侵襲性邊緣區(qū)域高度富集。5ALA−細胞主要與NE和PN亞型相關(guān)，相比之下，與所有其他區(qū)域相比，5ALA +細胞高度且獨特地富集了MES亞型，特別是5ALA−細胞。

對來自GBM患者(N = 36)的組織進行免疫組化，以測定NeuN的表達，NeuN代表侵襲性邊緣神經(jīng)元細胞相對于Core和Rim的比例。與浸潤性邊緣相比，核心區(qū)緊隨Rim區(qū)神經(jīng)元細胞比例最低。在侵襲邊緣觀察到的神經(jīng)元比例最高，進一步證實了空間分子特征。對顯著調(diào)控的前沿基因進行分層聚類分析顯示，相對于5ALA +細胞，CL-和PN特異性基因在Core、Rim和侵襲性切緣中高表達，而NE特異性基因在侵襲性切緣中表達最高。3例患者MES基因表達相對較低，7例患者MES基因表達相對較高。這一結(jié)果表明5ALA +人群中存在患者特異性MES基因表達變異性。GSEA顯示了這些轉(zhuǎn)錄和代謝狀態(tài)的雙重富集，其中發(fā)育狀態(tài)和GPM狀態(tài)在核心和Rim中富集，與所有其他區(qū)域相比，只有發(fā)育程序在侵襲性邊緣中富集。Te MTC狀態(tài)在5ALA−細胞中富集；GPM在5ALA+細胞中富集，表明5ALA+和5ALA−細胞不同，盡管膨脹邊緣微環(huán)境和ALA−細胞的代謝狀態(tài)不同。傷口反應(yīng)在5ALA+細胞中唯一富集。對于5ALA+細胞，GPM的富集評分最高，其次是Inf。這些結(jié)果強調(diào)了在空間上不同的GBM區(qū)域和5ALA-ssort細胞中差異轉(zhuǎn)錄和代謝狀態(tài)的激活。5ALA +細胞可能會保持類似于Core的GPM狀態(tài)。
 

Fig 2. GBM不同區(qū)域亞型、分子和代謝基因特征的富集

3. 5ALA +群體代表轉(zhuǎn)錄一致的侵襲性惡性細胞和髓系細胞，具有活躍的間充質(zhì)亞型和炎癥傷口反應(yīng)程序
為了驗證惡性GBM細胞可以獲得類似髓細胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的假設(shè)，首先通過tSNE分析GBM圖中的惡性和髓系細胞，然后進行Louvain聚類。CNV分析發(fā)現(xiàn)了一組獨特的非整倍體細胞，僅根據(jù)轉(zhuǎn)錄特征就被注釋為髓系細胞。剩余的髓系細胞主要是二倍體。對非整倍體和二倍體骨髓細胞(N = 132,654)進行了Louvain聚類的tSNE，得到了18個cluster。進行了Fisher精確檢驗，觀察非整倍體和二倍體細胞在cluster中的分布，并確定在特定簇中非整倍體細胞的過度代表。結(jié)果顯示，C8非整倍體細胞高度富集。通過計算Ucell評分來評估5ALA +基因標記的富集程度，并隨后將5ALA + Ucell評分映射到兩個髓系細胞群上：髓系非整倍體(MLA)細胞(N = 5171)和二倍體髓樣(DM) (N = 127,483)細胞。

MLA細胞在GPM、MES和tnf - α基因特征方面顯示出更高的UCell評分。MLA和DM細胞與非髓樣惡性細胞相比，都顯示出較高的UCell評分。MLA細胞中5ALA +和相關(guān)基因特征的高富集表明，盡管這種非整倍體群體在轉(zhuǎn)錄上與髓系細胞相似，但可能有助于5ALA +細胞群體的惡性效力。從GBmap數(shù)據(jù)集建立了一個矩陣，隨后使用CIBERSORTx算法從空間分辨的Core和基于5ALA的分類樣本(5ALA +和5ALA-)中反卷積轉(zhuǎn)錄組。通過CIBERSORTx對分數(shù)的估計顯示，與Core和5ALA -人群相比，5ALA +人群的MLA分數(shù)確實更高。

總的來說，這些數(shù)據(jù)證實了MES細胞狀態(tài)、活躍的inf傷口反應(yīng)轉(zhuǎn)錄程序和GPM代謝狀態(tài)在5ALA +細胞中占主導(dǎo)地位。此外，5ALA +細胞可能在分散的病灶內(nèi)保持缺氧依賴的GPM狀態(tài)，盡管在正常的侵襲性邊緣微環(huán)境中，MTC代謝狀態(tài)占主導(dǎo)地位。
 

Fig 3. 5ALA +基因在髓樣非整倍體、二倍體髓樣和非髓樣惡性細胞中的富集

5. 5ALA +細胞群類似于表達CD44的癌間充質(zhì)細胞
5ALA +細胞中g(shù)sc衍生的inf傷口反應(yīng)程序的激活提高了保留干細胞樣轉(zhuǎn)錄組景觀的可能性。通過基于5ALA +、5ALA−細胞和空間上不同的GBM區(qū)域的大量mRNA表達(SPRP)數(shù)據(jù)估計患者特異性干性指數(shù)(mRNAsi)來找出5ALA +細胞中的干細胞轉(zhuǎn)錄組特征。具有最高的干性指數(shù)，5ALA +細胞相對于所有未分類的腫瘤區(qū)域表現(xiàn)出明顯的特征，其中5ALA +細胞與核心和邊緣區(qū)域相比表現(xiàn)出明顯更高的干性特征。將TCGA-GBM樣本(代表腫瘤核心)分層為分子亞型，結(jié)果顯示，與5ALA +和5ALA -細胞相比，GBM亞型的mRNAsi較低。利用了來自代表5ALA -細胞的TCGA鄰近非腫瘤組織(NAT)的mRNAsi數(shù)據(jù)，并將其與代表腫瘤核心的TCGA-GBM組織進行了比較。Bootstrap之后的Wilcox測試顯示，與GBM核心相比，NAT區(qū)域的mRNAsi值顯著更高。認識到5ALA +細胞的獨特性，進行了干性與5ALA +特征基因之間的相關(guān)性分析。只有23個基因與mRNAsi呈顯著正相關(guān)，其他基因(N = 228)與mRNAsi呈顯著負相關(guān)。盡管5ALA +群體表現(xiàn)出較高的干性指數(shù)，但由于干性相關(guān)基因與5ALA +基因標記之間缺乏顯著的相關(guān)性，使得5ALA +細胞的干性特征無法確定。

基于Couturier等人的scRNA-seq數(shù)據(jù)集的tSNE圖，tSNE分析顯示，富含5ALA +基因標記的細胞與GP和OLC的定位明顯，但與包括截斷的放射狀膠質(zhì)細胞和癌癥間質(zhì)細胞在內(nèi)的混合群體存在顯著重疊。5ALA +可能類似于癌癥間充質(zhì)細胞，而不是截短的放射狀膠質(zhì)細胞，但也表明5ALA +細胞群中的細胞異質(zhì)性。
 

Fig 4. 5ALA +細胞代表表達CD44的間充質(zhì)細胞

6. 空間解析轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示了微環(huán)境中存在罕見的浸潤性5ALA +細胞
進一步利用空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)(stRNA-seq)對來自獨立IDH-wt GBM患者隊列(N = 16)的組織切片進行分析，研究了容納這些細胞的空間定位和周圍微環(huán)境。選擇ukf# 334作為具有代表性的組織樣本，說明5ALA +轉(zhuǎn)錄特征的共定位，具有MES和傷口反應(yīng)基因特征。此外，5ALA +富集的細胞在空間上接近GPM代謝狀態(tài)富集的區(qū)域和缺氧激活區(qū)域。GPM的空間共定位與缺氧密切相關(guān)，這為5ALA +細胞活躍的GPM狀態(tài)作為對代謝改變環(huán)境的補償機制提供了合理的解釋。與之前的研究結(jié)果一致，5ALA +細胞進一步表現(xiàn)為CD44的高表達。通過空間聚類分析轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性揭示了不同聚類的存在(N = 11)。C9和C7主要與5ALA +富集區(qū)存在空間重疊，這表明在5ALA +細胞群體中存在異質(zhì)性轉(zhuǎn)錄組景觀。5ALA- inv和5ALA- ct在5ALA +和傷口反應(yīng)基因特征中均富集，而5ALA- inv在MES中富集，進一步證明5ALA +侵襲性邊緣細胞可能經(jīng)歷向MES亞型的過渡。

為了更深入地了解5ALA +細胞相對于壞死腫瘤核心的定位和空間微環(huán)境的差異，進一步利用stRNA-seq數(shù)據(jù)在特定組織樣本中鑒定5ALA +基因特征富集區(qū)域。選擇了ukf# 313樣本，它代表一個壞死的腫瘤核心，周圍是假乳頭狀細胞，然后是一個CT區(qū)域。CNV的推斷提供了進一步的證據(jù)，表明CT中7號染色體的增加和10號染色體的缺失。GSEA分析顯示，細胞區(qū)域富含5ALA +基因標記的斑點在空間上遠離壞死核心。在樣本ukf# 269中，組織學(xué)分析顯示了CT和空間相鄰的NT區(qū)域之間的區(qū)別。CT和NT之間的空間邊界也得到了CNV分析的支持，其中CT的特征是7號染色體的增加和10號染色體的缺失。stRNA-seq分析揭示了CD44表達罕見的5ALA+細胞的存在周圍缺氧微管，遠離壞死核心，與髓系細胞共同定位。
 

Fig 5. GBM侵襲邊緣罕見浸潤性5ALA +細胞群的鑒定

6. 5ALA +細胞富集的細胞、轉(zhuǎn)錄和代謝狀態(tài)與腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)
與復(fù)發(fā)腫瘤相比，TCGA原發(fā)腫瘤中沒有富集基因特征，為了進一步研究獨特的5ALA +基因特征對復(fù)發(fā)和原發(fā)GBM患者生存的影響，分別對復(fù)發(fā)和原發(fā)腫瘤進行了單樣本GSEA (ssGSEA)，以獲得5ALA +基因特征。結(jié)合NES計算每個腫瘤樣本的5ALA +基因聯(lián)合標記評分，并與復(fù)發(fā)患者和原發(fā)患者的生存數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析。對于GLASS的復(fù)發(fā)腫瘤隊列，5ALA +基因標記評分與生存率呈顯著負相關(guān)，而原發(fā)腫瘤則沒有。多因素回歸分析顯示，5ALA +基因聯(lián)合標記與復(fù)發(fā)性GBM患者的較差生存率顯著相關(guān)。檢索了來自PDEs的原發(fā)細胞(N = 10,905)和復(fù)發(fā)細胞(N = 8833)的scRNA-seq數(shù)據(jù)。tSNE分析結(jié)合Louvain聚類，然后將5ALA + UCell評分映射到tSNE圖上，結(jié)果表明，在由GBM患者的原發(fā)性和復(fù)發(fā)性腫瘤細胞組成的不同聚類中，5ALA +基因特征明顯可見。對比分析證實了之前的假設(shè)，即復(fù)發(fā)性GBM細胞的5ALA + UCell評分明顯高于原發(fā)細，進一步強調(diào)了5ALA +基因標記與GBM復(fù)發(fā)之間的關(guān)聯(lián)。

綜上所述，5ALA +細胞的富集基因特征與GBM的低生存率和復(fù)發(fā)相關(guān)，這表明這些特征在腫瘤進展和疾病復(fù)發(fā)間隔中可能具有功能影響。
 

Fig 6. 5ALA +基因特征與GBM患者復(fù)發(fā)的關(guān)系

參考文獻：
Andrieux, G., Das, T., Griffin, M. et al. Spatially resolved transcriptomic profiles reveal unique defining molecular features of infiltrative 5ALA-metabolizing cells associated with glioblastoma recurrence. Genome Med 15, 48 (2023). https://doi.org/10.1186/s13073-023-01207-1IF: 12.3 Q1