結(jié)腸癌細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的共培養(yǎng)可概括結(jié)腸癌的侵襲特征

結(jié)腸癌是成人癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）、KRAS 或 BRAF基因中存在激活突變和/或 T 細(xì)胞浸潤(rùn)等特征均顯示與預(yù)后和/或治療反應(yīng)相關(guān)。免疫治療的成功取決于免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤的浸潤(rùn)以及來自影響免疫細(xì)胞分化和功能的腫瘤微環(huán)境（TME）的信號(hào)。TME 由細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）組成，在確定腫瘤免疫細(xì)胞功能方面發(fā)揮重要作用。特別是CAFs，促進(jìn)了結(jié)腸癌的發(fā)生，進(jìn)展，轉(zhuǎn)移形成和治療耐藥性。當(dāng)被腫瘤細(xì)胞激活時(shí)，CAFs 可能反過來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲性行為。此外，CAFs 有助于免疫抑制性 TME 的產(chǎn)生。從功能上講，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分的持續(xù)沉積是 CAF 介導(dǎo)的關(guān)鍵特征，可影響侵襲性腫瘤細(xì)胞行為和免疫抑制的多個(gè)方面。

在結(jié)腸癌中，“間充質(zhì)型”共識(shí)分子亞型4（CMS4）的特征是 CAF 含量高和反映血管生成、炎癥和免疫抑制的基因表達(dá)程序。盡管 CMS4 MSI-L 結(jié)腸癌具有免疫抑制性質(zhì)，但已從此類腫瘤中分離出腫瘤特異性新抗原反應(yīng)性 T 細(xì)胞。因此，提高 CMS4 結(jié)腸癌中腫瘤反應(yīng)性 T 細(xì)胞的活性可能是一種很有前景的治療策略。新型治療策略的設(shè)計(jì)和測(cè)試需要用于研究CMS4（富含CAF）結(jié)腸癌的模型系統(tǒng)。為了揭示腫瘤細(xì)胞和CAFs之間的相互作用如何決定腫瘤行為，需要基于類器官的模型系統(tǒng)，其中兩種細(xì)胞類型以可重復(fù)和穩(wěn)健的方式共培養(yǎng)。

在荷蘭烏得勒支大學(xué)醫(yī)學(xué)中心以及鹿特丹伊拉斯謨大學(xué)醫(yī)學(xué)中心研究課題組的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，該團(tuán)隊(duì)提出了結(jié)腸癌類器官和CAFs在高度標(biāo)準(zhǔn)化的無血清培養(yǎng)基和優(yōu)化的ECM中的長(zhǎng)期共培養(yǎng)模型。在這些條件下，腫瘤細(xì)胞和CAFs自發(fā)地組織成上層結(jié)構(gòu)，同時(shí)使ECM變硬和收縮。上皮腺結(jié)構(gòu)與CAF軌道直接接觸，與患者結(jié)腸腫瘤的組織學(xué)非常相似。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析進(jìn)一步證明了共培養(yǎng)誘導(dǎo)的臨床相關(guān)腫瘤細(xì)胞和 CAF 表型的產(chǎn)生。兩種細(xì)胞類型都需要產(chǎn)生抑制T細(xì)胞增殖的免疫抑制環(huán)境。具體內(nèi)容發(fā)表在 Frontiers in Immunology 期刊題為“Co-cultures of colon cancer cells and cancer-associated fibroblasts recapitulate the aggressive features of mesenchymal-like colon cancer”。

在共培養(yǎng)模型中，首先將小類器官接種在含有基質(zhì)膠和膠原蛋白I 的共培養(yǎng)基質(zhì)中,然后在共培養(yǎng)基中加入CAFs（圖1A）。在最初的2-3天內(nèi)，CAFs在含有類器官的基質(zhì)液滴周圍組織成一個(gè)連續(xù)的圓圈（圖1 B、C）。在液滴內(nèi)，CAFs組織成基質(zhì)軌跡，同時(shí)，類器官沿著這些CAFs軌跡重組。最終，所有單獨(dú)的類器官融合成一個(gè)圍繞 CAF 軌道的單個(gè)實(shí)體 （圖1 D），形成肉眼可見的“微型腫瘤”（圖1 E）。這些數(shù)據(jù)表明，在優(yōu)化條件下與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)CAFs會(huì)導(dǎo)致自發(fā)的ECM重組和類似腫瘤組織的上層結(jié)構(gòu)的組裝。目前尚不清楚是什么原因?qū)е铝思?xì)胞重組。

圖1 腫瘤細(xì)胞和CAFs自發(fā)重組成宏觀微型腫瘤。

接下來，實(shí)驗(yàn)旨在從機(jī)制上深入了解 CAFs 和腫瘤細(xì)胞如何相互影響彼此的表型以誘導(dǎo) ECM 重塑和細(xì)胞重組。為此，通過FACS分選對(duì)單培養(yǎng)（CAF-2d、CAF-3d、類器官）和共培養(yǎng)（CAF/類器官）分離的兩種細(xì)胞類型進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序�？偣卜治隽� 949 個(gè)細(xì)胞，確定了3 個(gè)腫瘤細(xì)胞群（clusters 1-3）和 3 個(gè)CAF 群（clusters 4-6）。腫瘤細(xì)胞與 CAFs 共培養(yǎng)導(dǎo)致 cluster-2 細(xì)胞減少，而 cluster-3 細(xì)胞強(qiáng)烈擴(kuò)增。為了深入了解不同腫瘤細(xì)胞群和CAFs之間的表型差異，進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析。Cluster-1 腫瘤細(xì)胞的特征是缺氧和糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)，Cluster-2由95%的單培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞組成，增殖相關(guān)基因表達(dá)最高，Cluster-3 腫瘤細(xì)胞主要由共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞組成，上皮基因（KRT19、EPCAM、CDH1）表達(dá)較低，間充質(zhì)基因（SPARC、TIMP1、VIM、MMP2）和基因集（Hallmark EMT）表達(dá)較高，反映了（部分）上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 （EMT）。此外，CMS4 識(shí)別基因集（CMS2 RF）（主要由 CAF 表達(dá)的基因組成）在 Cluster-3 中表達(dá)水平顯著更高。這些分析表明，共培養(yǎng)中腫瘤細(xì)胞和 CAFs 之間的相互作用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變，從上皮狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀?間充質(zhì)混合狀態(tài)，如在 CMS4 結(jié)腸癌中觀察到的那樣。

然后分析在單一培養(yǎng)和共培養(yǎng)中生長(zhǎng)的CAFs之間的表型差異。Cluster 4 從單一培養(yǎng)物中分離的 CAF 組成，Cluster 6 從共培養(yǎng)物中分離的 CAF 組成，Cluster 5 由來自單一培養(yǎng)物和共培養(yǎng)物的 CAF 組成（圖2 A）。差異基因表達(dá)分析顯示，Cluster 6 中多種細(xì)胞外基質(zhì)基因的表達(dá)發(fā)生了變化，包括COL1A1的下調(diào)，COL4A1和COL4A的上調(diào)（圖2 B）。CAFs表達(dá)了非常高水平的膠原交聯(lián)酶LOX和膠原裂解酶MMP1。使用免疫熒光分析表明CAF產(chǎn)生的膠原蛋白-4形成了與腫瘤細(xì)胞相互作用的基底膜狀網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖4 C）。此外，與單培養(yǎng)相比，共培養(yǎng)CAFs中反映缺氧和缺氧誘導(dǎo)因子1-α靶點(diǎn)的基因集顯著更高（圖2 D），進(jìn)一步的分析表明，與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)了 CAF 代謝的重大轉(zhuǎn)變，參與糖酵解的基因表達(dá)增加（圖2 E），免疫熒光分析表明共培養(yǎng)CAFs中LDHA和 GAPDH 的表達(dá)顯著升高（圖2 F、G）。這些數(shù)據(jù)說明，共培養(yǎng)的 CAFs 獲得缺氧、糖酵解和基質(zhì)重塑表型。

圖2 共培養(yǎng)的 CAFs 獲得缺氧、糖酵解和基質(zhì)重塑表型。

目前根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征和結(jié)直腸癌細(xì)胞的異質(zhì)性對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行分型，定義了四種不同的結(jié)直腸癌亞型（CMS1-CMS4）。為了研究單一培養(yǎng)和共培養(yǎng)中的 CAF 表型是否與人類結(jié)腸癌中發(fā)現(xiàn)的 CAF 表型相似，實(shí)驗(yàn)利用了來自 29 名患者的原發(fā)性結(jié)腸腫瘤的大型單細(xì)胞 RNA 序列數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)表明，共培養(yǎng)中的 CAFs 類似于在人類CMS1和CMS4結(jié)腸癌中富集的具有缺氧糖酵解表型的CAFs亞群。

上述共培養(yǎng)的幾個(gè)特征先前與癌癥中的免疫抑制有關(guān)，包括ECM硬化，缺氧和糖酵解代謝�；�因表達(dá)分析顯示，共培養(yǎng)（Cluster-6）中的CAFs表達(dá)非常高水平的免疫抑制基因，包括CXCL8、PTGS2、TGFB1和VEGFA （圖3 A）。對(duì)單一培養(yǎng)或共培養(yǎng)條件培養(yǎng)基的分析表明，共培養(yǎng)比單一培養(yǎng)通常分泌更高水平的TGFβ1（圖3 B）、VEGFA （圖3 C）和乳酸（圖 3 D、E），這表明產(chǎn)生了潛在的免疫抑制環(huán)境。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與不同CAF系共培養(yǎng)的細(xì)胞中分泌因子的數(shù)量存在差異，例如CR16CAF比LCAF5分泌更高水平的TGFB1，這反映了CAFs的異質(zhì)性。最后，為了直接測(cè)試免疫抑制潛力，分析了條件培養(yǎng)基對(duì)從四個(gè)不同供體中分離的 T 細(xì)胞活化的影響。從CAF或腫瘤細(xì)胞單培養(yǎng)中分離的培養(yǎng)基分別對(duì)T細(xì)胞增殖無抑制作用和有中等抑制作用。相比之下，從 CAF/腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)中分離的培養(yǎng)基在所有四種情況下均有效抑制 T 細(xì)胞增殖（圖3 F、G）。這些數(shù)據(jù)表明，CAFs和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)引起的部分表型變化，導(dǎo)致了免疫抑制微環(huán)境的產(chǎn)生。

圖3 共培養(yǎng)中免疫抑制微環(huán)境的產(chǎn)生。

一般來說，特異性器官微環(huán)境對(duì)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的免疫環(huán)境的影響及其對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷的反應(yīng)是免疫腫瘤學(xué)研究的一個(gè)重要主題。該報(bào)告中開發(fā)的共培養(yǎng)模型系統(tǒng)通過合理添加特定的細(xì)胞類型和/或細(xì)胞因子和/或細(xì)胞外基質(zhì)成分，可以開始對(duì)器官特異性微環(huán)境進(jìn)行建模，以評(píng)估它們對(duì)T細(xì)胞行為的影響。類器官和永生化 CAFs 的共培養(yǎng)概括了侵襲性間充質(zhì)型人結(jié)直腸癌的組織學(xué)、生理學(xué)和免疫抑制特征。該模型可用于研究免疫抑制的機(jī)制，并測(cè)試針對(duì)CAFs和腫瘤細(xì)胞之間串?dāng)_的治療策略，也可以進(jìn)一步修改以代表不同的結(jié)腸癌亞型和（器官特異性）微環(huán)境。最終，這將有助于開發(fā)涉及免疫療法的新型聯(lián)合治療策略。

參考文獻(xiàn)：Strating E, Verhagen MP, Wensink E, Dünnebach E, Wijler L, Aranguren I, De la Cruz AS, Peters NA, Hageman JH, van der Net MMC, van Schelven S, Laoukili J, Fodde R, Roodhart J, Nierkens S, Snippert H, Gloerich M, Rinkes IB, Elias SG, Kranenburg O. Co-cultures of colon cancer cells and cancer-associated fibroblasts recapitulate the aggressive features of mesenchymal-like colon cancer. Front Immunol. 2023 May 16;14:1053920. doi: 10.3389/fimmu.2023.1053920. PMID: 37261365; PMCID: PMC10228738.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37261365/

小編旨在分享、學(xué)習(xí)、交流生物科學(xué)等領(lǐng)域的研究進(jìn)展。如有侵權(quán)或引文不當(dāng)請(qǐng)聯(lián)系小編修正。如有任何的想法以及建議，歡迎聯(lián)系小編。感謝各位的瀏覽以及關(guān)注！
微信搜索公眾號(hào)“Naturethink”，了解更多細(xì)胞體外仿生培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用。

點(diǎn)擊了解
細(xì)胞流體剪切力|共培養(yǎng)|壓力培養(yǎng)|牽張應(yīng)變|血管培養(yǎng)|平行平板流動(dòng)腔|儀器|上海泉眾機(jī)電科技有限公司Naturethink
http://www.naturethink.com/

Naturethink多細(xì)胞培養(yǎng)|共培養(yǎng)體系|共培養(yǎng)模型|共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)|動(dòng)態(tài)細(xì)胞共培養(yǎng)|仿血流多細(xì)胞動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)系統(tǒng)
http://www.naturethink.com/?product/81.html