血流紊亂導致的CLEC-2依賴性血小板內(nèi)皮下沉積有助于小鼠動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化主要發(fā)生在血流紊亂（d-flow）的區(qū)域，即流量低、混亂方向的非層流。當暴露于 d-flow 時，血管內(nèi)皮細胞發(fā)生表型變化，導致細胞因子釋放和白細胞募集增加。單核細胞是白細胞的主要類型，它們被遷移到發(fā)炎的血管壁中，成為富含脂質(zhì)的泡沫細胞，這是動脈粥樣硬化斑塊的標志。

血管損傷后，循環(huán)中的血小板迅速粘附在受傷處內(nèi)膜下組織形成止血栓以填充傷口。血小板還有助于炎癥過程，這在包括動脈粥樣硬化在內(nèi)的許多病理條件下至關(guān)重要。血小板粘附到血流紊亂區(qū)域被證明通過促進單核細胞粘附來促進動脈粥樣硬化形成。研究表明，血小板轉(zhuǎn)錄組特征與動脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細胞有關(guān)。先前的研究揭示了動脈粥樣硬化期間d-flow激活的內(nèi)皮細胞如何導致白細胞募集。然而，血小板如何對d-flow產(chǎn)生反應，從而導致動脈粥樣硬化的機制仍不清楚。

基于此，蘇州大學唐仲英醫(yī)學研究院血液學研究中心和美國俄克拉荷馬醫(yī)學研究基金會心血管生物學項目成員在一項研究中，以載脂蛋白E缺陷型（ApoE-/-）和 LDL 受體敲除（LDLr-/-）小鼠為研究對象，建立了小鼠部分頸動脈結(jié)扎術(shù)（PCL）誘導的頸動脈 d-flow 模型，通過免疫染色或透射電子顯微鏡觀察d-flow誘導的血小板在內(nèi)皮下或斑塊中的沉積，通過特異性基因敲除小鼠進一步探討了血小板內(nèi)皮下沉積的機制。研究結(jié)果揭示了血小板在動脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)域調(diào)節(jié)血管炎癥的新作用。研究成果發(fā)表在 Theranostics 期刊題為“CLEC-2-dependent platelet subendothelial accumulation by flow disturbance contributes to atherogenesis in mice”。

首先，為了研究血小板在d-flow誘導的動脈粥樣硬化中的作用，實驗使用免疫染色法檢測了喂食高脂飲食（HFD）的LDL-r-/- 或 ApoE-/- 小鼠主動脈弓動脈粥樣硬化斑塊的連續(xù)切片。共聚焦成像分析顯示，4周后LDL-r-/- 或 ApoE-/- 小鼠主動脈弓斑塊中存在血小板。為了驗證這一點，LDL-r-/- 小鼠進行PCL以產(chǎn)生 d-flow，然后進行HFD 喂養(yǎng)以產(chǎn)生頸動脈粥樣硬化。結(jié)果顯示，PCL 1周后的小鼠頸動脈斑塊中CD42d+ 血小板積聚。這些結(jié)果證明，通過單細胞技術(shù)，血小板與動脈粥樣硬化斑塊中的巨噬細胞存在關(guān)聯(lián)，并暗示血小板可能出現(xiàn)在動脈粥樣硬化的相對早期發(fā)展中。

然后，使用PCL模型繼續(xù)探討了d-flow 是否誘導內(nèi)皮下間隙中的血小板沉積。結(jié)果顯示，d-flow 持續(xù)2天后，除了粘附在LCA的內(nèi)皮上外，還在內(nèi)皮下間隙誘導了大量血小板，相比之下，右頸總動脈（RCA）對照的內(nèi)皮或內(nèi)皮下間隙均未檢測到血小板（圖1 A、B）。使用共聚焦圖像的三維（3D）重建進行進一步觀察，證實了豐富的CD42d+ 血小板在內(nèi)皮下間隙的沉積（圖1 C）。為了驗證循環(huán)血小板的內(nèi)皮下沉積，將表達EGFP的血小板注入接受PCL 2天的小鼠中，檢查EGFP標記的血小板是否積聚在頸動脈d-flow影響區(qū)域的內(nèi)皮下（圖1 D左）。結(jié)果顯示，PCL后在LCA內(nèi)皮下檢測到表達EGFP的血小板，但未在RCA檢測到（圖1 D右）。此外，d-flow誘導內(nèi)皮變形以及白細胞和血小板在擴大的內(nèi)皮下間隙中沉積。值得注意的是，血小板可能與單核細胞接觸（圖1 E）。

圖1 血流紊亂誘導小鼠血小板內(nèi)皮下沉積。

眾所周知，血小板在炎癥期間與白細胞相互作用并促進白細胞募集。接下來，實驗研究了d-flow下血小板內(nèi)皮下沉積的動態(tài)變化及其與白細胞浸潤的相關(guān)性。對PCL后不同時間點頸動脈的定量分析顯示，血小板和F4/80+ 單核細胞/巨噬細胞的內(nèi)膜和內(nèi)皮下沉積在PCL后6 h出現(xiàn)，在2天時達到峰值，并在7 d后保持一定水平（圖2 A、B、C）。進一步檢查顯示，沉積的血小板與單核細胞/巨噬細胞（F4/80+）或中性粒細胞（Ly6G+）接觸，在PCL后形成單核細胞/巨噬細胞-血小板或中性粒細胞-血小板聚集體（圖2 D），且患區(qū)與單核細胞/巨噬細胞聚集的血小板占總血小板的百分比顯著高于中性粒細胞，表明血小板在內(nèi)皮下沉積過程中主要與單核細胞/巨噬細胞相互作用。

此外，還檢查了 d-flow 是否誘導循環(huán)單核細胞-血小板聚集體（MPA）的增加，因為循環(huán) MPA 是動脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)病機制的標志物。結(jié)果表明，PCL術(shù)后2天循環(huán)血液中MPA與總單核細胞的比值增加（圖2 E）。這些結(jié)果支持了d-flow下血小板的內(nèi)皮下沉積與單核細胞/巨噬細胞相關(guān)的觀點。

然后，實驗探索了哪種類型的分子介導了 d-flow 誘導的血小板-單核細胞相互作用和內(nèi)皮下沉積。已發(fā)現(xiàn)血小板 CLEC-2 調(diào)節(jié)血管完整性，然而，CLEC-2 是否有助于 d-flow 誘導的血小板和單核細胞相互作用及其內(nèi)皮下沉積尚不清楚。為了測試血小板 CLEC-2 是否調(diào)節(jié)體內(nèi) d-flow 誘導的血小板內(nèi)皮下沉積，使用小鼠模型Clec2fl/fl 和 Pf4-Cre。PCL后顯示血小板以MPA形式或單獨形式沉積在WT小鼠變形內(nèi)皮區(qū)域，而血小板敲除CLEC-2可顯著抑制血小板和單核細胞在內(nèi)皮細胞上的沉積。為了研究CLEC-2是否有助于d-flow誘導的血小板和單核細胞相互作用，使用小鼠單核細胞/巨噬細胞系RAW264.7，發(fā)現(xiàn)血小板孵育促進了RAW264.7的遷移，而與CLEC-2敲除血小板一起孵育可減少RAW264.7細胞遷移。這些結(jié)果表明，CLEC-2 在介導單核細胞-血小板相互作用及其 d-flow 下內(nèi)皮下沉積中起主要作用。

圖2 d-flow 誘導的血小板內(nèi)皮下沉積與單核/巨噬細胞有關(guān)。

最后，為了研究血小板 CLEC-2 如何介導單核細胞-血小板聚集體的形成，研究人員檢測了 d-flow 是否誘導單核細胞表達平足蛋白（PDPN），PDPN 是一種I型跨膜糖蛋白和已知的 CLEC-2 內(nèi)源性配體，據(jù)報道在炎癥期間在單核細胞/巨噬細胞上表達。首先在體外分析了 RAW264.7 細胞在振蕩流（OS，10 ± 5 dyn/cm²）刺激 12 小時后的 PDPN 表達，結(jié)果顯示，OS刺激后PDPN的表達比靜態(tài)細胞上調(diào)約3倍，蛋白質(zhì)水平顯著增加約6倍。然后又在體內(nèi)PCL后分析了PDPN在血管內(nèi)膜和培養(yǎng)基中的表達，結(jié)果顯示，d-flow刺激2天后，PDPN的表達比對照RCA上調(diào)約6倍。進一步分析顯示，PDPN在d-flow刺激的F4/80+ 單核細胞/巨噬細胞中高度表達。

為了檢查單核細胞/巨噬細胞PDPN是否通過d-flow介導血小板和單核細胞/巨噬細胞內(nèi)皮下沉積，使用已建立的小鼠模型Pdpnfl/fl 和 LysM-cre。相比Pdpn敲除小鼠，轉(zhuǎn)基因 LysM-cre小鼠顯著降低單核細胞/巨噬細胞中的PDPN蛋白水平。PCL 后2天 LCA 中，Mye Pdpn-/- 小鼠血小板和單核細胞/巨噬細胞的內(nèi)膜沉積減少，表明單核細胞/巨噬細胞PDPN在體內(nèi)通過d-flow介導內(nèi)皮下血小板和單核細胞/巨噬細胞的積聚。

然后進一步確定了敲除血小板 CLEC-2 是否會減少動脈粥樣硬化，通過骨髓移植建立血小板CLEC-2缺失嵌合體Ldlr-/- 小鼠，接受PCL并用HFD喂養(yǎng)3周。結(jié)果顯示，在Plt Clec2-/- 移植的Ldlr-/- 小鼠中斑塊面積與血管腔面積的之比和巨噬細胞的沉積量分別減少了55.81%（圖3 A、B）和41.59%（圖3 A、C）。這些結(jié)果表明，血小板 CLEC-2 缺失可能是通過抑制血小板和單核細胞/巨噬細胞內(nèi)皮下沉積來減少d-flow 形成的動脈粥樣硬化斑塊。

圖3 血小板CLEC-2缺失可減弱d-flow誘導的動脈粥樣硬化斑塊形成。

圖4 圖形概要

研究揭示了一種響應d-flow的新的CLEC-2-依賴性血小板內(nèi)皮下沉積機制以調(diào)節(jié)血管炎癥。

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)血小板通過d-flow在小鼠內(nèi)皮下和動脈粥樣硬化斑塊中沉積，這可能在動脈粥樣硬化開始過程中單核細胞的募集和遷移中起關(guān)鍵作用。這些數(shù)據(jù)擴展了我們對動脈粥樣硬化早期事件的了解，并揭示了血小板對d-flow 誘導的血管炎癥和動脈粥樣硬化的重要性。

參考文獻：Tang C, Wang L, Sheng Y, Zheng Z, Xie Z, Wu F, You T, Ren L, Xia L, Ruan C, Zhu L. CLEC-2-dependent platelet subendothelial accumulation by flow disturbance contributes to atherogenesis in mice. Theranostics. 2021 Oct 3;11(20):9791-9804. doi: 10.7150/thno.64601. PMID: 34815786; PMCID: PMC8581433.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34815786/

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