妊娠期母體甲基供體攝入對IUGR豬模型回腸DNA甲基化和功能的影響
出生體重較低的宮內(nèi)生長受限（Intrauterine growth restriction，IUGR）影響腸道的生長、形態(tài)和功能，導(dǎo)致生長性能不佳和高死亡率。最近研究表明，IUGR導(dǎo)致腸道中不同的DNA甲基化，可能在IUGR腸道損傷中起關(guān)鍵作用。母體營養(yǎng)可以通過表觀遺傳修飾（例如DNA甲基化和組蛋白乙酰化）導(dǎo)致后代的永久表型變化。妊娠期膳食補充甲基供體（methyl donor，MET）可提高后代的出生體重和出生后生長速度。然而在IUGR豬模型中，母體補充MET對胃腸道發(fā)育的影響及其潛在機制尚不清楚。
2024年2月4日，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所車煉強教授團(tuán)隊在《Journal of Animal Science and Biotechnology》 雜志發(fā)表題為“Effects of maternal methyl donor intake during pregnancy on ileum methylation and function in an intrauterine growth restriction pig model”的研究論文，探討了在豬IUGR模型中，補充母體膳食甲基供體（MET）是否通過改善腸道生長、功能和回腸的DNA甲基化來緩解IUGR并增強后代的生長性能。
標(biāo)題：Effects of maternal methyl donor intake during pregnancy on ileum methylation and function in an intrauterine growth restriction pig model（妊娠期母體甲基供體攝入對宮內(nèi)生長受限豬模型回腸甲基化及功能的影響）
時間：2024-2-4
期刊：J Anim Sci Biotechnol
影響因子：IF 7
技術(shù)平臺： RRBS等
研究摘要：
從配種到分娩，研究將40頭多產(chǎn)母豬分配到對照組或MET飲食組。分娩后，從8窩仔豬中選擇8對IUGR和正常出生體重（normal birth weight，NBW)的仔豬進(jìn)行初乳前取樣。結(jié)果表明，母體補充MET有降低IUGR發(fā)生率和增加仔豬平均斷奶體重的趨勢。此外，母體MET補充顯著降低了母豬和新生仔豬中血漿中異亮氨酸、半胱氨酸、尿素和總氨基酸濃度。此外還增加了新生仔豬空腸中的乳糖酶和蔗糖酶活性。MET添加導(dǎo)致新生仔豬回腸中甲硫氨酸合酶活性降低，同時增加回腸中甜菜堿同型半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶活性。回腸的DNA甲基化分析（IUGR/NBW對中選擇16個回腸樣本RRBS (每組1-8個)）表明，補充MET可提高新生仔豬回腸DNA CpG位點的甲基化水平。下調(diào)的差異甲基化基因在葉酸結(jié)合、胰島素受體信號通路和內(nèi)皮細(xì)胞增殖中富集。而上調(diào)的甲基化基因在生長激素受體信號通路和一氧化氮生物合成過程中富集。
總之，本研究表明母體補充MET可以降低IUGR發(fā)生率，增加仔豬斷奶窩重，可能與更好的腸道功能和甲基化狀態(tài)有關(guān)。
實驗結(jié)果：
（1）與基因組特征相關(guān)的全基因組 CpG 甲基化
與CON_IUGR組和CON_NBW組相比，MET_NBW組的DNA甲基化顯著增加。盡管與MET/IUGR相比，MET/NBW的DNA甲基化增加了2.4%，但不同出生體重的仔豬沒有明顯的甲基化改變。
表1：母體膳食補充MET對新生仔豬回腸DNA甲基化水平的影響
CpG甲基化模式分析（圖1A）顯示，與CON_NBW組相比，CON_IUGR組仔豬的回腸呈現(xiàn)低甲基化水平。然而在MET_IUGR和CON_IUGR組中，MET補充后回腸的CpG甲基化水平顯著增加（圖1B）。所有組中在CpG島觀察到CpG甲基化水平低于CpG島岸（圖1C）。此外，所有樣本在啟動子區(qū)域中心顯示出甲基化的類似下降趨勢（圖1D），這種趨勢逐漸向genebody區(qū)域增加（圖1D）。
圖1：與基因組特征以及IUGR和MET誘導(dǎo)的DMC相關(guān)的全基因組CpG位點甲基化。
A-B. 不同基因組特征的平均CpG甲基化水平。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM
C-D. 與基因區(qū)域和元件模式相關(guān)的CpG甲基化水平
（2）胞嘧啶甲基化的基因組分布
在本研究中，與上游2kb、下游2kb或genebody區(qū)域的甲基化peak重疊基因稱為甲基化基因。其中，1659個甲基化基因在CON_IUGR組和CON_NBW組中被鑒定為差異表達(dá)基因。CON_IUGR組中包括1044個高甲基化基因和1245個低甲基化基因。在MET_IUGR組和MET_NBW組中，共有1887個甲基化基因被鑒定為差異表達(dá)基因，其中包括CON_IUGR組中的1233個高甲基化基因和1406個低甲基化基因。差異甲基化位點位于genebody中，小部分位于外顯子和啟動子中。
表2：不同組不同基因區(qū)的差異甲基化基因數(shù)量
（3）BW和MET誘導(dǎo)的DMR甲基化譜變化
接下來分別在CON_IUGR組 vs CON_NBW組和MET_IUGR組 vs MET_NBW組之間鑒定出差異甲基化CpG（DMCs）。DMCs基于<0.05的Q值和兩組之間的甲基化差異>10%標(biāo)準(zhǔn)。在評估CON_IUGR和CON_NBW仔豬回腸時，共鑒定出 80265個DMC，包括 33000個高甲基化DMC和47265個低甲基化 DMC。隨后在分析MET_IUGR仔豬回腸和MET_NBW仔豬回腸時鑒定了100249個DMC，包括45221 個高甲基化DMC和55028個低甲基化DMC。最后，在MET_IUGR仔豬與CON_IUGR仔豬的比較中鑒定出87919個DMC，包括47883個高甲基化DMC和40036個低甲基化DMC。前1000個差異甲基化位點熱圖顯示，該位點子集可以非常容易區(qū)分 BW 組和 MET 補充組（圖2）。
圖2：仔豬回腸前1000個差異甲基化位點熱圖。
此熱圖中的每行對應(yīng)于單個位點，而每列對應(yīng)于單個樣本。ACON_IUGR和CON_NBW（A），BMET_IUGR和MET_NBW（B），CMET_IUGR和CON_IUGR（C）。熱圖旁邊的分支樹狀圖（dendrogram）對應(yīng)于樣本之間的關(guān)系，通過使用這1000個位點進(jìn)行聚類來確定。所有圖表顯示相似數(shù)量位點的相對高甲基化和低甲基化（紅色到藍(lán)色）。這種可視化方法有助于鑒定和比較不同樣本之間的甲基化模式，從而揭示可能與特定表型或處理（如MET補充）相關(guān)的基因調(diào)控區(qū)域。
（4）BW和MET誘導(dǎo)的回腸DNA甲基化變化
研究結(jié)果顯示，IUGR（宮內(nèi)生長受限）組和NBW（正常出生體重）組新生仔豬的回腸DNA甲基化存在顯著差異（圖3A）。主成分分析表明，與喂食對照飲食和甲基供體飲食的兩組母豬相比，IUGR仔豬的回腸DNA甲基化存在顯著差異（圖3B）。在甲基供體組的IUGR仔豬與CON組的NBW仔豬之間，回腸組織DNA甲基化水平的差異較小。
表明IUGR狀態(tài)可能會影響新生仔豬回腸的DNA甲基化模式，而母體飲食中甲基供體補充可能有助于減少IUGR仔豬與正常體重仔豬之間的甲基化差異。這種甲基化模式的變化可能與腸道功能和發(fā)育有關(guān)，進(jìn)而影響仔豬的生長表現(xiàn)和健康狀況。
圖3：體重和MET補充誘導(dǎo)的差異甲基化CpG位點（DMCs）。
A. 不同組仔豬中DMC數(shù)量Venn圖。顯示了與不同對之間重疊的DMCs進(jìn)行基因交叉匹配的結(jié)果。
B. 主成分分析（PCA）顯示不同組的DNA甲基化差異。
（5）BW和MET誘導(dǎo)的染色體差異甲基化
不同組的差異甲基化在覆蓋所有染色體的Circos圖中表示。Circos圖表示組間差異甲基化區(qū)域（圖4A和B）。最外圈（不同顏色顯示）代表不同的染色體，特定染色體名稱在圖上標(biāo)記。第二個圓圈（黑色和白色圈）代表基因密度。第三圈（藍(lán)色圈）代表處理組的甲基化水平。第四圈表示差異甲基化水平，最內(nèi)圈表示CON組甲基化水平。在比較CON_IUGR組和CON_NBW組時，DMC位于1-3、6和12號染色體上（圖4A和C）。6號染色體的二甲基化水平最高，包括3177個高甲基化和5097個低甲基化DMC。比較MET_IUGR組和MET_NBW組時，DMC位于X染色體上，有5864個高甲基化和3434個低甲基化DMC（圖4B和D），結(jié)果表明補充MET后回腸甲基化水平增加。
圖4：仔豬回腸DMC甲基化譜Circos圖。
A和C. CON_IUGR組與CON_NBW組的比較。
B和D. MET_IUGR組與MET_NBW組的比較。
藍(lán)色代表不同組DMCs的甲基化水平。粉色代表不同組DMC的差異甲基化水平。
（6）DNA甲基化的GO富集分析
基因甲基化狀態(tài)比較分析結(jié)果表明，CON_IUGR組和CON_NBW組之間存在顯著差異的甲基化模式。大多數(shù)DMRs位于基因上下游±2kb區(qū)域。許多基因在IUGR低甲基化中富集，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控、發(fā)育過程和細(xì)胞表面基因（圖5B）。部分基因在IUGR中顯著下調(diào)，甲基化基因傾向于轉(zhuǎn)錄因子活性和葉酸結(jié)合中富集。在生物學(xué)過程中，基因在與激素反應(yīng)、細(xì)胞粘附、胰島素受體信號通路、內(nèi)皮細(xì)胞增殖和脂肪細(xì)胞分化相關(guān)功能中富集（圖5A）。對這些基因的進(jìn)一步研究可以闡明IUGR仔豬回腸中低甲基化功能。
與MET_NBW組相比，MET_IUGR組的基因甲基化狀態(tài)降低，低甲基化基因在分子功能類別中傾向于在鈣鐵結(jié)合中富集，在細(xì)胞成分類別中傾向于在細(xì)胞表面基因中富集（圖5B）。基因甲基化狀態(tài)比較分析表明，MET_IUGR組和CON_IUGR組之間存在差異甲基化模式。上調(diào)的甲基化基因傾向于生長激素受體信號通路通過JAK-STAT信號通路、ER相關(guān)錯誤折疊蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子β激活受體活性和一氧化氮（NO）生物合成過程中富集。顯著富集的下調(diào)基因包括胰島素樣生長因子I結(jié)合、脂肪酸β-氧化、鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶活性、鈣離子結(jié)合和DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（圖5C)。
圖5：仔豬回腸中由DNA甲基化驅(qū)動的代表性基因GO富集分析。
A. CON_IUGR組與CON_NBW組比較；
B. MET_IUGR組與MET_NBW組比較；
C. MET_IUGR組與CON_IUGR組比較。
研究小結(jié)：
IUGR可導(dǎo)致豬模型中腸道DNA甲基化異常。通過調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)及其在各種生物過程中的功能，例如NO生物合成過程，通過JAK-STAT激素受體通路和多巴胺受體信號通路，可以通過母體MET補充來緩解DNA甲基化變化。這些發(fā)現(xiàn)可能為養(yǎng)豬業(yè)和人類患者IUGR改善提供方向。
參考文獻(xiàn)：
Lin Y, Wu J, Zhuo Y, Feng B, Fang Z, Xu S, Li J, Zhao H, Wu D, Hua L, Che L. Effects of maternal methyl donor intake during pregnancy on ileum methylation and function in an intrauterine growth restriction pig model. J Anim Sci Biotechnol. 2024 Feb 4;15(1):19. pii: 10.1186/s40104-023-00970-w. doi: 10.1186/s40104-023-00970-w. PubMed PMID: 38310243.
2024年2月4日，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所車煉強教授團(tuán)隊在《Journal of Animal Science and Biotechnology》 雜志發(fā)表題為“Effects of maternal methyl donor intake during pregnancy on ileum methylation and function in an intrauterine growth restriction pig model”的研究論文，探討了在豬IUGR模型中，補充母體膳食甲基供體（MET）是否通過改善腸道生長、功能和回腸的DNA甲基化來緩解IUGR并增強后代的生長性能。
標(biāo)題：Effects of maternal methyl donor intake during pregnancy on ileum methylation and function in an intrauterine growth restriction pig model（妊娠期母體甲基供體攝入對宮內(nèi)生長受限豬模型回腸甲基化及功能的影響）
時間：2024-2-4
期刊：J Anim Sci Biotechnol
影響因子：IF 7
技術(shù)平臺： RRBS等
研究摘要：
從配種到分娩，研究將40頭多產(chǎn)母豬分配到對照組或MET飲食組。分娩后，從8窩仔豬中選擇8對IUGR和正常出生體重（normal birth weight，NBW)的仔豬進(jìn)行初乳前取樣。結(jié)果表明，母體補充MET有降低IUGR發(fā)生率和增加仔豬平均斷奶體重的趨勢。此外，母體MET補充顯著降低了母豬和新生仔豬中血漿中異亮氨酸、半胱氨酸、尿素和總氨基酸濃度。此外還增加了新生仔豬空腸中的乳糖酶和蔗糖酶活性。MET添加導(dǎo)致新生仔豬回腸中甲硫氨酸合酶活性降低，同時增加回腸中甜菜堿同型半胱氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶活性。回腸的DNA甲基化分析（IUGR/NBW對中選擇16個回腸樣本RRBS (每組1-8個)）表明，補充MET可提高新生仔豬回腸DNA CpG位點的甲基化水平。下調(diào)的差異甲基化基因在葉酸結(jié)合、胰島素受體信號通路和內(nèi)皮細(xì)胞增殖中富集。而上調(diào)的甲基化基因在生長激素受體信號通路和一氧化氮生物合成過程中富集。
總之，本研究表明母體補充MET可以降低IUGR發(fā)生率，增加仔豬斷奶窩重，可能與更好的腸道功能和甲基化狀態(tài)有關(guān)。
實驗結(jié)果：
（1）與基因組特征相關(guān)的全基因組 CpG 甲基化
與CON_IUGR組和CON_NBW組相比，MET_NBW組的DNA甲基化顯著增加。盡管與MET/IUGR相比，MET/NBW的DNA甲基化增加了2.4%，但不同出生體重的仔豬沒有明顯的甲基化改變。
表1：母體膳食補充MET對新生仔豬回腸DNA甲基化水平的影響CpG甲基化模式分析（圖1A）顯示，與CON_NBW組相比，CON_IUGR組仔豬的回腸呈現(xiàn)低甲基化水平。然而在MET_IUGR和CON_IUGR組中，MET補充后回腸的CpG甲基化水平顯著增加（圖1B）。所有組中在CpG島觀察到CpG甲基化水平低于CpG島岸（圖1C）。此外，所有樣本在啟動子區(qū)域中心顯示出甲基化的類似下降趨勢（圖1D），這種趨勢逐漸向genebody區(qū)域增加（圖1D）。
圖1：與基因組特征以及IUGR和MET誘導(dǎo)的DMC相關(guān)的全基因組CpG位點甲基化。
A-B. 不同基因組特征的平均CpG甲基化水平。數(shù)據(jù)表示為平均值±SEM
C-D. 與基因區(qū)域和元件模式相關(guān)的CpG甲基化水平
（2）胞嘧啶甲基化的基因組分布
在本研究中，與上游2kb、下游2kb或genebody區(qū)域的甲基化peak重疊基因稱為甲基化基因。其中，1659個甲基化基因在CON_IUGR組和CON_NBW組中被鑒定為差異表達(dá)基因。CON_IUGR組中包括1044個高甲基化基因和1245個低甲基化基因。在MET_IUGR組和MET_NBW組中，共有1887個甲基化基因被鑒定為差異表達(dá)基因，其中包括CON_IUGR組中的1233個高甲基化基因和1406個低甲基化基因。差異甲基化位點位于genebody中，小部分位于外顯子和啟動子中。
表2：不同組不同基因區(qū)的差異甲基化基因數(shù)量（3）BW和MET誘導(dǎo)的DMR甲基化譜變化
接下來分別在CON_IUGR組 vs CON_NBW組和MET_IUGR組 vs MET_NBW組之間鑒定出差異甲基化CpG（DMCs）。DMCs基于<0.05的Q值和兩組之間的甲基化差異>10%標(biāo)準(zhǔn)。在評估CON_IUGR和CON_NBW仔豬回腸時，共鑒定出 80265個DMC，包括 33000個高甲基化DMC和47265個低甲基化 DMC。隨后在分析MET_IUGR仔豬回腸和MET_NBW仔豬回腸時鑒定了100249個DMC，包括45221 個高甲基化DMC和55028個低甲基化DMC。最后，在MET_IUGR仔豬與CON_IUGR仔豬的比較中鑒定出87919個DMC，包括47883個高甲基化DMC和40036個低甲基化DMC。前1000個差異甲基化位點熱圖顯示，該位點子集可以非常容易區(qū)分 BW 組和 MET 補充組（圖2）。
圖2：仔豬回腸前1000個差異甲基化位點熱圖。此熱圖中的每行對應(yīng)于單個位點，而每列對應(yīng)于單個樣本。ACON_IUGR和CON_NBW（A），BMET_IUGR和MET_NBW（B），CMET_IUGR和CON_IUGR（C）。熱圖旁邊的分支樹狀圖（dendrogram）對應(yīng)于樣本之間的關(guān)系，通過使用這1000個位點進(jìn)行聚類來確定。所有圖表顯示相似數(shù)量位點的相對高甲基化和低甲基化（紅色到藍(lán)色）。這種可視化方法有助于鑒定和比較不同樣本之間的甲基化模式，從而揭示可能與特定表型或處理（如MET補充）相關(guān)的基因調(diào)控區(qū)域。
（4）BW和MET誘導(dǎo)的回腸DNA甲基化變化
研究結(jié)果顯示，IUGR（宮內(nèi)生長受限）組和NBW（正常出生體重）組新生仔豬的回腸DNA甲基化存在顯著差異（圖3A）。主成分分析表明，與喂食對照飲食和甲基供體飲食的兩組母豬相比，IUGR仔豬的回腸DNA甲基化存在顯著差異（圖3B）。在甲基供體組的IUGR仔豬與CON組的NBW仔豬之間，回腸組織DNA甲基化水平的差異較小。
表明IUGR狀態(tài)可能會影響新生仔豬回腸的DNA甲基化模式，而母體飲食中甲基供體補充可能有助于減少IUGR仔豬與正常體重仔豬之間的甲基化差異。這種甲基化模式的變化可能與腸道功能和發(fā)育有關(guān)，進(jìn)而影響仔豬的生長表現(xiàn)和健康狀況。
圖3：體重和MET補充誘導(dǎo)的差異甲基化CpG位點（DMCs）。
B. 主成分分析（PCA）顯示不同組的DNA甲基化差異。
（5）BW和MET誘導(dǎo)的染色體差異甲基化
不同組的差異甲基化在覆蓋所有染色體的Circos圖中表示。Circos圖表示組間差異甲基化區(qū)域（圖4A和B）。最外圈（不同顏色顯示）代表不同的染色體，特定染色體名稱在圖上標(biāo)記。第二個圓圈（黑色和白色圈）代表基因密度。第三圈（藍(lán)色圈）代表處理組的甲基化水平。第四圈表示差異甲基化水平，最內(nèi)圈表示CON組甲基化水平。在比較CON_IUGR組和CON_NBW組時，DMC位于1-3、6和12號染色體上（圖4A和C）。6號染色體的二甲基化水平最高，包括3177個高甲基化和5097個低甲基化DMC。比較MET_IUGR組和MET_NBW組時，DMC位于X染色體上，有5864個高甲基化和3434個低甲基化DMC（圖4B和D），結(jié)果表明補充MET后回腸甲基化水平增加。
A和C. CON_IUGR組與CON_NBW組的比較。
B和D. MET_IUGR組與MET_NBW組的比較。
藍(lán)色代表不同組DMCs的甲基化水平。粉色代表不同組DMC的差異甲基化水平。
（6）DNA甲基化的GO富集分析
基因甲基化狀態(tài)比較分析結(jié)果表明，CON_IUGR組和CON_NBW組之間存在顯著差異的甲基化模式。大多數(shù)DMRs位于基因上下游±2kb區(qū)域。許多基因在IUGR低甲基化中富集，如轉(zhuǎn)錄調(diào)控、發(fā)育過程和細(xì)胞表面基因（圖5B）。部分基因在IUGR中顯著下調(diào)，甲基化基因傾向于轉(zhuǎn)錄因子活性和葉酸結(jié)合中富集。在生物學(xué)過程中，基因在與激素反應(yīng)、細(xì)胞粘附、胰島素受體信號通路、內(nèi)皮細(xì)胞增殖和脂肪細(xì)胞分化相關(guān)功能中富集（圖5A）。對這些基因的進(jìn)一步研究可以闡明IUGR仔豬回腸中低甲基化功能。
與MET_NBW組相比，MET_IUGR組的基因甲基化狀態(tài)降低，低甲基化基因在分子功能類別中傾向于在鈣鐵結(jié)合中富集，在細(xì)胞成分類別中傾向于在細(xì)胞表面基因中富集（圖5B）。基因甲基化狀態(tài)比較分析表明，MET_IUGR組和CON_IUGR組之間存在差異甲基化模式。上調(diào)的甲基化基因傾向于生長激素受體信號通路通過JAK-STAT信號通路、ER相關(guān)錯誤折疊蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子β激活受體活性和一氧化氮（NO）生物合成過程中富集。顯著富集的下調(diào)基因包括胰島素樣生長因子I結(jié)合、脂肪酸β-氧化、鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶活性、鈣離子結(jié)合和DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（圖5C)。
圖5：仔豬回腸中由DNA甲基化驅(qū)動的代表性基因GO富集分析。
A. CON_IUGR組與CON_NBW組比較；
B. MET_IUGR組與MET_NBW組比較；
C. MET_IUGR組與CON_IUGR組比較。
研究小結(jié)：
IUGR可導(dǎo)致豬模型中腸道DNA甲基化異常。通過調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)及其在各種生物過程中的功能，例如NO生物合成過程，通過JAK-STAT激素受體通路和多巴胺受體信號通路，可以通過母體MET補充來緩解DNA甲基化變化。這些發(fā)現(xiàn)可能為養(yǎng)豬業(yè)和人類患者IUGR改善提供方向。
參考文獻(xiàn)：
Lin Y, Wu J, Zhuo Y, Feng B, Fang Z, Xu S, Li J, Zhao H, Wu D, Hua L, Che L. Effects of maternal methyl donor intake during pregnancy on ileum methylation and function in an intrauterine growth restriction pig model. J Anim Sci Biotechnol. 2024 Feb 4;15(1):19. pii: 10.1186/s40104-023-00970-w. doi: 10.1186/s40104-023-00970-w. PubMed PMID: 38310243.
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