WGBS+ChIP-seq揭示食管癌的細胞類型和癌癥特異性表觀遺傳調(diào)控
食管癌是一種常見的惡性腫瘤，有兩種亞型：鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma，ESCC）和腺癌（adenocarcinoma，EAC）。區(qū)分細胞類型特異性分子特征和癌癥特異性特征具有挑戰(zhàn)性。表觀遺傳學上，多項研究報告了食管癌中的分子變化，特別是在DNA甲基化水平上，食管癌的DNA甲基化組需要通過全基因組單堿基分辨率方法（如全基因組重亞硫酸鹽測序，WGBS）進行全面表征。特別是關(guān)于細胞類型和癌癥特異性差異甲基化區(qū)域（differentially methylated regions，DMRs）和部分甲基化結(jié)構(gòu)域（partially methylated domains，PMDs）的幾個重要問題尚待進一步表征，包括：①這些結(jié)構(gòu)域的區(qū)域特異性程度（即細胞類型和癌癥特異性DMR/PMD比例）；② DMRs和PMDs在癌癥生物學中的功能意義；③ 腫瘤發(fā)生過程中DMRs和PMDs變化的潛在機制。
2023年8月23日，中山大學第七附屬醫(yī)院科研中心鄭悅媛副研究員等為第一作者，美國Samuel Oschin綜合癌癥研究所De-Chen Lin研究團隊與以色列耶路撒冷希伯來大學Benjamin P. Berman研究團隊為共同通訊在《Genome Biology》雜志發(fā)表題為“Comprehensive analyses of partially methylated domains and differentially methylated regions in esophageal cancer reveal both cell-type- and cancer-specific epigenetic regulation”的研究論文，對食管癌中部分甲基化結(jié)構(gòu)域和差異甲基化區(qū)域的綜合分析揭示了細胞類型和癌癥特異性的表觀遺傳調(diào)控機制。
標題：Comprehensive analyses of partially methylated domains and differentially methylated regions in esophageal cancer reveal both cell-type- and cancer-specific epigenetic regulation（對食管癌部分甲基化結(jié)構(gòu)域和差異甲基化區(qū)域的綜合分析揭示了細胞類型和癌癥特異性的表觀遺傳調(diào)控）
時間：2023-8-23
期刊：Genome Biology
影響因子：12.3
技術(shù)平臺：ChIP-seq、WGBS等
研究摘要：
對21個ESCC組織、5個非惡性食管鱗狀（NESQ）組織、12個EAC/GEJ腫瘤組織和7個非惡性GEJ（NGEJ）組織在內(nèi)的兩種不同食管癌亞型及其相應(yīng)的非惡性組織，共計45例食管樣本的WGBS數(shù)據(jù)進行分析，并開發(fā)一種新的sequence-aware方法鑒定大范圍的PMD，揭示腫瘤樣本中PMD甲基化水平和基因組分布的高異質(zhì)性。此外，研究鑒定出與抑制轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)B區(qū)和高體細胞突變相關(guān)的亞型特異性PMD。盡管這些PMDs的基因組位點在正常細胞中已經(jīng)建立，但在腫瘤中丟失程度顯著更高。H3K36me2的細胞類型特異性沉積可能是PMDs基因組分布的基礎(chǔ)。在較小的基因組范圍內(nèi)，對每個亞型鑒定出細胞類型特異性和癌癥特異性的差異甲基化區(qū)域（DMRs）。通過在這些DMRs中進行結(jié)合motif分析，展示了細胞類型特異性轉(zhuǎn)錄因子HNF4A維持了其在正常細胞中產(chǎn)生的結(jié)合位點，同時在食管腺癌中與新的合作伙伴如FOSL1共同建立新的結(jié)合位點。最后研究人員利用泛組織單細胞和泛癌癥表觀基因組數(shù)據(jù)集進行后期驗證，證明食管癌中的大部分細胞類型特異性PMDs和差異甲基化區(qū)域（DMRs），實際上源于相關(guān)細胞類型的其他癌癥中共同發(fā)生的標記物。
總之，本研究結(jié)果促進了對正常和惡性狀態(tài)下不同基因組范圍DNA甲基化水平變化的理解，為細胞類型特異性和癌癥特異性表觀遺傳調(diào)控提供了新的機制性見解。
研究結(jié)果：
（1）開發(fā)新的sequence-aware calling方法來鑒定PMD
研究人員基于MethylSeekR中使用的Hidden Markov模型（HMM）開發(fā)了一種sequence-aware PMD的calling方法，命名為MMSeekR（Multi-model PMD SeekR）。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，MMSeekR成功地在所有樣本中一致地鑒定出PMDs，并具有高穩(wěn)定性和一致性。且MMSeekR幾乎可以完全分離不同癌癥類型。
圖1：通過sequence-aware的多模型PMD calling鑒定食管樣品中的PMD（MMSeekR）
A. 本研究設(shè)計的圖形模型。
B. 點圖顯示全基因組中所有CpG、CGI啟動子內(nèi)CpG、PMDs、SINE、LINE和LTR在不同樣本中的平均甲基化水平。
C. 開發(fā)新的PMD calling方法。MethylSeekR α評分檢測了全基因組中201個連續(xù)CpG的滑動窗口中甲基化水平分布。α得分<1對應(yīng)于向高或低甲基化水平的極化分布（即HMDs），而α得分≥1對應(yīng)于向中間甲基化水平分布（即PMD）。PCC顯示基于NN模型預(yù)測低甲基化評分與實際甲基化水平之間的相關(guān)性。強負相關(guān)表示有利于PMD的區(qū)域，而弱/零相關(guān)則有利于HMD。
D. 使用三種PMD calling方法的前5000個可變30 kb tiles對45個食管樣本進行PCA分析。
E-F. 代表性窗口顯示MMSeekR成功鑒定PMD，但MethPipe（E）或MethylSeekR（F）均未檢測到PMD
（2）食管樣本中共有和亞型特異性PMD表征
圖2：共有和亞型特異性PMD表征
A. 45個食管樣品的DNA甲基化譜的代表性窗口。平均甲基化值顯示在連續(xù)且不重疊的10 kb tiles中。
B. 基于兩種食管癌類型的頻率和重疊，鑒定出PMD類別。
C. 線圖顯示食管腫瘤中不同PMD類別的平均甲基化水平，其中每條線代表一個樣本。
D. 使用TCGA甲基化數(shù)據(jù)集觀察到類似的線圖模式，顯示樣品間的平均值和標準偏差。下面熱圖中的每一行都表示一個單獨樣本。
E. 條形圖顯示W(wǎng)GBS PMD與染色質(zhì)B區(qū)室重疊的百分比。D和E中的甲基化數(shù)據(jù)集來自TCGA ESCA HM450k芯片，包括91個ESCC和75個EAC樣品。
F. 基于WGS的體細胞突變率，分別針對每個WGBS PMD類別計算突變率。EAC WGS數(shù)據(jù)集：276個樣本；ESCC WGS數(shù)據(jù)集：508個樣本
C-D. 使用EAC特異性（C）或ESCC特異性（D）PMD及其下調(diào)基因的Cistrome-GO富集分析。顯示了最顯著的前15個條通路，右側(cè)顯示了每個通路中富集的基因數(shù)量。
E. EAC特異性（左圖）和ESCC特異性PMD（右圖）的甲基化譜代表性基因組窗口。
F. 火山圖顯示位于E基因組結(jié)構(gòu)域內(nèi)基因在相應(yīng)癌癥亞型中下調(diào)。用平均表達水平（FPKM）鑒定差異表達基因，F(xiàn)PKM≥0.1，調(diào)整后的p<0.05和絕對倍數(shù)變化>2。
C、D、F中的表達RNA-seq來自TCGA ESCA項目，包括76個ESCC和78個EAC樣品
（3）H3K36me2以細胞類型特異性方式與PMD呈負相關(guān)
B. 代表性基因組位點顯示ChIP-seq的H3K36me2信號，以及WGBS數(shù)據(jù)的亞型特異性PMD。
C. 四種不同PMD類別的HNSCC細胞系中H3K36me2 ChIP-seq水平的聚合圖。H3K36me2 ChIP-seq數(shù)據(jù)集獲自GSE149670。A、C中的H3K36me2信號通過5kb窗口中IP與Input的CPM比進行歸一化
（4）食管癌中的亞型特異性差異甲基化區(qū)域（DMR）
B. 密度圖顯示hypoDMR的大小分布；堆疊條形圖顯示與不同基因組特征重疊的hypoDMR比例。
C-D. EAC（C）或ESCC（D）hypoDMR或隨機基因組區(qū)域（背景）內(nèi)的ATAC-seq信號的聚合圖，這些區(qū)域包含了10個隨機選擇的具有相同CpG密度區(qū)域。ATAC-seq信號來自TCGA，并用CPM方法進行歸一化。
E-F. EAC（E）或ESCC（F）hypoDMR及其相應(yīng)亞型中上調(diào)基因進行Cistrome-GO富集分析。顯示了最顯著的前15條通路。每條通路中富集的基因數(shù)量顯示在右側(cè)。表達數(shù)據(jù)集來自TCGA ESCA項目。
G-H. ELMER方法鑒定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合motif，以EAC（G）或ESCC（H）hypoDMR為前景，隨機區(qū)域為背景。TF家族的注釋來自TFClass數(shù)據(jù)庫。
I-J. 在匹配的細胞系中通過ChIP-seq、H3K27ac ChIP-seq和WGBS在EAC（GATA4）（I）和ESCC（TP63）（J）中最強富集TFs進行實驗驗證。左側(cè)顯示與亞型hypoDMR重疊peaks；重疊peaks百分比在柱狀圖中表示。左上角餅圖表示所有與亞型hypoDMR重疊peaks中具有TF結(jié)合motif的peaks比例。
（5）腫瘤特異性hypoDMR的鑒定
B. 堆疊條形圖顯示與不同基因組特征重疊的ts hypoDMR比例。
C-D. EAC（C）或ESCC（D）ts-hypoDMRs及其各自亞型中與相應(yīng)非惡性樣本相比上調(diào)的基因進行Cistrome-GO富集分析。顯示了最顯著的前15條通路。食管癌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來自TCGA和GSE149609。
E. 散點圖顯示與cts-hypoDMR相比，EAC ts-hypoDMR中富集的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。X軸表示EAC和匹配的非惡性GEJ樣品之間的表達倍數(shù)變化。Y軸顯示EAC ts和cts hypoDMR之間轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的δ富集評分。表達數(shù)據(jù)來自TCGA，motif富集分析通過ELMER方法進行。
F. EAC ts-hypoDMRs中包含的HNF4A識別motif顯著多于cts-hypoDMRs。
G. 與cts-hypoDMRs相比，更多的HNF4A peaks與ts-hypoDMRs重疊。peak來自ESO26（GSE132813）和OE19細胞系的HNF4A ChIP-seq。
H. HNF4A在ts-hypoDMRs中與AP-1家族共有，而在cts-hypoDMRs中與FOXA1/2共有。
I. 在ESO26和OE19細胞系中，使用qPCR實驗分析scramble shRNA與shHNF4A組中HNF4A mRNA表達。
J-K. scramble shRNA或shHNF4A組在ESO26（J）和OE19（K）細胞中進行 FOSL1 ChIP-qPCR分析。IgG用作陰性對照抗體。實驗設(shè)置3個生物學重復(fù)。p值通過雙側(cè)t檢驗確定***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05；ns，不顯著；nd，不可檢測
（6）PMD和hypoDMR表現(xiàn)出強細胞類型特異性表觀基因組特征
B. 非惡性食管樣品中不同PMD的平均甲基化水平火山圖。通過雙尾t檢驗確定了具有顯著差異的區(qū)域，F(xiàn)DR截止值<0.1。
C. 不同hypoDMR類別在兩種非惡性食管樣本中的平均甲基化水平線圖。
D. 非惡性食管樣品中不同hypoDMR類別的平均甲基化水平火山圖。
E. UMAP圖顯示細胞簇（左），ESCC與EAC特異性PMD（中）或ESCC與EAC特異性hypoDMR（右）中的ATAC-seq水平。
F-G. 點圖顯示在樣本水平上，ESCC與EAC的特異性PMD（F）或ESCC與EAC的特異性hypoDMR（G）中的ATAC-seq值
（7）亞型特異性PMD和hypoDMR的泛癌分析
D-E. 分別對B和C中的甲基化差異進行點圖定量。
F. t-SNE圖顯示癌癥類型簇。
G-H. 腫瘤樣本中ESCC與EAC特異性PMD（G）以及ESCC與EAC特異性hypoDMR（H）中的ATAC-seq水平。
I-M. 點圖分別以G和H表示ATAC-seq值的量化。K–M精度召回曲線分別表示亞型特異性PMD（K）、DMR（L）或兩者（M）的平均甲基化。
研究小結(jié)
本研究強調(diào)了正常細胞類型中存在細胞類型特異性的PMDs和DMRs，這些細胞類型在惡性細胞中得以保留。本研究是首次展示PMDs在正常、前體和惡性狀態(tài)下的顯著細胞類型特異性。雖然先前的研究表明DMRs包含組織特異性的調(diào)控區(qū)域，但本研究提出了一種區(qū)分細胞類型特異性與癌癥特異性區(qū)域的方法，并利用這些方法來鑒定腫瘤特異性的調(diào)控機制。
通過區(qū)分細胞類型特異性和癌癥特異性的表觀遺傳區(qū)域，研究人員能夠更深入地理解腫瘤的調(diào)控機制，這對于癌癥的診斷、治療和預(yù)防具有重要意義。
參考文獻：
Zheng Y, Ziman B, Ho AS, Sinha UK, Xu LY, Li EM, Koeffler HP, Berman BP, Lin DC. Comprehensive analyses of partially methylated domains and differentially methylated regions in esophageal cancer reveal both cell-type- and cancer-specific epigenetic regulation. Genome Biol. 2023 Aug 24;24(1):193. pii: 10.1186/s13059-023-03035-3. doi: 10.1186/s13059-023-03035-3. PubMed PMID: 37620896.
2023年8月23日，中山大學第七附屬醫(yī)院科研中心鄭悅媛副研究員等為第一作者，美國Samuel Oschin綜合癌癥研究所De-Chen Lin研究團隊與以色列耶路撒冷希伯來大學Benjamin P. Berman研究團隊為共同通訊在《Genome Biology》雜志發(fā)表題為“Comprehensive analyses of partially methylated domains and differentially methylated regions in esophageal cancer reveal both cell-type- and cancer-specific epigenetic regulation”的研究論文，對食管癌中部分甲基化結(jié)構(gòu)域和差異甲基化區(qū)域的綜合分析揭示了細胞類型和癌癥特異性的表觀遺傳調(diào)控機制。
標題：Comprehensive analyses of partially methylated domains and differentially methylated regions in esophageal cancer reveal both cell-type- and cancer-specific epigenetic regulation（對食管癌部分甲基化結(jié)構(gòu)域和差異甲基化區(qū)域的綜合分析揭示了細胞類型和癌癥特異性的表觀遺傳調(diào)控）
時間：2023-8-23
期刊：Genome Biology
影響因子：12.3
技術(shù)平臺：ChIP-seq、WGBS等
研究摘要：
對21個ESCC組織、5個非惡性食管鱗狀（NESQ）組織、12個EAC/GEJ腫瘤組織和7個非惡性GEJ（NGEJ）組織在內(nèi)的兩種不同食管癌亞型及其相應(yīng)的非惡性組織，共計45例食管樣本的WGBS數(shù)據(jù)進行分析，并開發(fā)一種新的sequence-aware方法鑒定大范圍的PMD，揭示腫瘤樣本中PMD甲基化水平和基因組分布的高異質(zhì)性。此外，研究鑒定出與抑制轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)B區(qū)和高體細胞突變相關(guān)的亞型特異性PMD。盡管這些PMDs的基因組位點在正常細胞中已經(jīng)建立，但在腫瘤中丟失程度顯著更高。H3K36me2的細胞類型特異性沉積可能是PMDs基因組分布的基礎(chǔ)。在較小的基因組范圍內(nèi)，對每個亞型鑒定出細胞類型特異性和癌癥特異性的差異甲基化區(qū)域（DMRs）。通過在這些DMRs中進行結(jié)合motif分析，展示了細胞類型特異性轉(zhuǎn)錄因子HNF4A維持了其在正常細胞中產(chǎn)生的結(jié)合位點，同時在食管腺癌中與新的合作伙伴如FOSL1共同建立新的結(jié)合位點。最后研究人員利用泛組織單細胞和泛癌癥表觀基因組數(shù)據(jù)集進行后期驗證，證明食管癌中的大部分細胞類型特異性PMDs和差異甲基化區(qū)域（DMRs），實際上源于相關(guān)細胞類型的其他癌癥中共同發(fā)生的標記物。
總之，本研究結(jié)果促進了對正常和惡性狀態(tài)下不同基因組范圍DNA甲基化水平變化的理解，為細胞類型特異性和癌癥特異性表觀遺傳調(diào)控提供了新的機制性見解。
研究結(jié)果：
（1）開發(fā)新的sequence-aware calling方法來鑒定PMD
研究人員基于MethylSeekR中使用的Hidden Markov模型（HMM）開發(fā)了一種sequence-aware PMD的calling方法，命名為MMSeekR（Multi-model PMD SeekR）。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，MMSeekR成功地在所有樣本中一致地鑒定出PMDs，并具有高穩(wěn)定性和一致性。且MMSeekR幾乎可以完全分離不同癌癥類型。
圖1：通過sequence-aware的多模型PMD calling鑒定食管樣品中的PMD（MMSeekR）
A. 本研究設(shè)計的圖形模型。
B. 點圖顯示全基因組中所有CpG、CGI啟動子內(nèi)CpG、PMDs、SINE、LINE和LTR在不同樣本中的平均甲基化水平。
C. 開發(fā)新的PMD calling方法。MethylSeekR α評分檢測了全基因組中201個連續(xù)CpG的滑動窗口中甲基化水平分布。α得分<1對應(yīng)于向高或低甲基化水平的極化分布（即HMDs），而α得分≥1對應(yīng)于向中間甲基化水平分布（即PMD）。PCC顯示基于NN模型預(yù)測低甲基化評分與實際甲基化水平之間的相關(guān)性。強負相關(guān)表示有利于PMD的區(qū)域，而弱/零相關(guān)則有利于HMD。
D. 使用三種PMD calling方法的前5000個可變30 kb tiles對45個食管樣本進行PCA分析。
E-F. 代表性窗口顯示MMSeekR成功鑒定PMD，但MethPipe（E）或MethylSeekR（F）均未檢測到PMD
（2）食管樣本中共有和亞型特異性PMD表征
圖2：共有和亞型特異性PMD表征
B. 基于兩種食管癌類型的頻率和重疊，鑒定出PMD類別。
C. 線圖顯示食管腫瘤中不同PMD類別的平均甲基化水平，其中每條線代表一個樣本。
D. 使用TCGA甲基化數(shù)據(jù)集觀察到類似的線圖模式，顯示樣品間的平均值和標準偏差。下面熱圖中的每一行都表示一個單獨樣本。
E. 條形圖顯示W(wǎng)GBS PMD與染色質(zhì)B區(qū)室重疊的百分比。D和E中的甲基化數(shù)據(jù)集來自TCGA ESCA HM450k芯片，包括91個ESCC和75個EAC樣品。
F. 基于WGS的體細胞突變率，分別針對每個WGBS PMD類別計算突變率。EAC WGS數(shù)據(jù)集：276個樣本；ESCC WGS數(shù)據(jù)集：508個樣本
圖3：亞型特異性PMD調(diào)控細胞類型的特異性功能
A-B. 在EAC（A）和ESCC（B）中，PMD覆蓋基因表達水平與非PMD呈癌癥特異性方式降低。C-D. 使用EAC特異性（C）或ESCC特異性（D）PMD及其下調(diào)基因的Cistrome-GO富集分析。顯示了最顯著的前15個條通路，右側(cè)顯示了每個通路中富集的基因數(shù)量。
E. EAC特異性（左圖）和ESCC特異性PMD（右圖）的甲基化譜代表性基因組窗口。
F. 火山圖顯示位于E基因組結(jié)構(gòu)域內(nèi)基因在相應(yīng)癌癥亞型中下調(diào)。用平均表達水平（FPKM）鑒定差異表達基因，F(xiàn)PKM≥0.1，調(diào)整后的p<0.05和絕對倍數(shù)變化>2。
C、D、F中的表達RNA-seq來自TCGA ESCA項目，包括76個ESCC和78個EAC樣品
（3）H3K36me2以細胞類型特異性方式與PMD呈負相關(guān)
圖4：H3K36me2標記與PMD呈細胞類型特異性負相關(guān)
A. 食管癌細胞系中H3K36me2 ChIP-seq水平在四種不同PMD類別中的聚合圖：共有PMD、EAC特異性PMD、ESCC特異性PMD、共有HMD。B. 代表性基因組位點顯示ChIP-seq的H3K36me2信號，以及WGBS數(shù)據(jù)的亞型特異性PMD。
C. 四種不同PMD類別的HNSCC細胞系中H3K36me2 ChIP-seq水平的聚合圖。H3K36me2 ChIP-seq數(shù)據(jù)集獲自GSE149670。A、C中的H3K36me2信號通過5kb窗口中IP與Input的CPM比進行歸一化
（4）食管癌中的亞型特異性差異甲基化區(qū)域（DMR）
圖5：食管癌中的亞型特異性DMRs
A. 比較EAC和ESCC腫瘤，鑒定出癌癥hypoDMR。FDR<0.05和絕對δ甲基化水平>0.2區(qū)域被識別為DMRs。B. 密度圖顯示hypoDMR的大小分布；堆疊條形圖顯示與不同基因組特征重疊的hypoDMR比例。
C-D. EAC（C）或ESCC（D）hypoDMR或隨機基因組區(qū)域（背景）內(nèi)的ATAC-seq信號的聚合圖，這些區(qū)域包含了10個隨機選擇的具有相同CpG密度區(qū)域。ATAC-seq信號來自TCGA，并用CPM方法進行歸一化。
E-F. EAC（E）或ESCC（F）hypoDMR及其相應(yīng)亞型中上調(diào)基因進行Cistrome-GO富集分析。顯示了最顯著的前15條通路。每條通路中富集的基因數(shù)量顯示在右側(cè)。表達數(shù)據(jù)集來自TCGA ESCA項目。
G-H. ELMER方法鑒定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合motif，以EAC（G）或ESCC（H）hypoDMR為前景，隨機區(qū)域為背景。TF家族的注釋來自TFClass數(shù)據(jù)庫。
I-J. 在匹配的細胞系中通過ChIP-seq、H3K27ac ChIP-seq和WGBS在EAC（GATA4）（I）和ESCC（TP63）（J）中最強富集TFs進行實驗驗證。左側(cè)顯示與亞型hypoDMR重疊peaks；重疊peaks百分比在柱狀圖中表示。左上角餅圖表示所有與亞型hypoDMR重疊peaks中具有TF結(jié)合motif的peaks比例。
（5）腫瘤特異性hypoDMR的鑒定
圖6：腫瘤特異性低甲基化差異甲基化區(qū)域（hypoDMRs）的鑒定
A. 每個EAC hypoDMR的DNA甲基化水平熱圖。每列表示一個樣本，行按EAC和NGEJ之間的delta平均甲基化排序（左）。在EAC腫瘤和NGEJ樣本（右）之間使用FDR截止值的單尾t檢驗鑒定EAC ts hypoDMR<0.05。B. 堆疊條形圖顯示與不同基因組特征重疊的ts hypoDMR比例。
C-D. EAC（C）或ESCC（D）ts-hypoDMRs及其各自亞型中與相應(yīng)非惡性樣本相比上調(diào)的基因進行Cistrome-GO富集分析。顯示了最顯著的前15條通路。食管癌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來自TCGA和GSE149609。
E. 散點圖顯示與cts-hypoDMR相比，EAC ts-hypoDMR中富集的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。X軸表示EAC和匹配的非惡性GEJ樣品之間的表達倍數(shù)變化。Y軸顯示EAC ts和cts hypoDMR之間轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的δ富集評分。表達數(shù)據(jù)來自TCGA，motif富集分析通過ELMER方法進行。
F. EAC ts-hypoDMRs中包含的HNF4A識別motif顯著多于cts-hypoDMRs。
G. 與cts-hypoDMRs相比，更多的HNF4A peaks與ts-hypoDMRs重疊。peak來自ESO26（GSE132813）和OE19細胞系的HNF4A ChIP-seq。
H. HNF4A在ts-hypoDMRs中與AP-1家族共有，而在cts-hypoDMRs中與FOXA1/2共有。
I. 在ESO26和OE19細胞系中，使用qPCR實驗分析scramble shRNA與shHNF4A組中HNF4A mRNA表達。
J-K. scramble shRNA或shHNF4A組在ESO26（J）和OE19（K）細胞中進行 FOSL1 ChIP-qPCR分析。IgG用作陰性對照抗體。實驗設(shè)置3個生物學重復(fù)。p值通過雙側(cè)t檢驗確定***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05；ns，不顯著；nd，不可檢測
（6）PMD和hypoDMR表現(xiàn)出強細胞類型特異性表觀基因組特征
圖7：PMD和hypoDMR表現(xiàn)出強細胞類型特異性表觀基因組特征
A. 不同PMD在兩種非惡性食管樣本中的平均甲基化水平線圖，非惡性樣本中的這些變化與腫瘤中變化相似（圖2C）。B. 非惡性食管樣品中不同PMD的平均甲基化水平火山圖。通過雙尾t檢驗確定了具有顯著差異的區(qū)域，F(xiàn)DR截止值<0.1。
C. 不同hypoDMR類別在兩種非惡性食管樣本中的平均甲基化水平線圖。
D. 非惡性食管樣品中不同hypoDMR類別的平均甲基化水平火山圖。
E. UMAP圖顯示細胞簇（左），ESCC與EAC特異性PMD（中）或ESCC與EAC特異性hypoDMR（右）中的ATAC-seq水平。
F-G. 點圖顯示在樣本水平上，ESCC與EAC的特異性PMD（F）或ESCC與EAC的特異性hypoDMR（G）中的ATAC-seq值
（7）亞型特異性PMD和hypoDMR的泛癌分析
圖8：泛癌數(shù)據(jù)集中PMD和hypoDMR分析
A–C. TCGA腫瘤譜顯示癌癥類型簇（A）、ESCC與EAC特異性PMD（B）和ESCC與EAC特異性hypoDMR（C）中的DNA甲基化水平。A基于TCGA的聚類方案表示泛胃腸道癌（COAD、READ、STAD和EAC）和泛鱗狀細胞癌（ESCC、HNSC、LUSC以及CESC和BLCA的子集）。樣本數(shù)量為8915。D-E. 分別對B和C中的甲基化差異進行點圖定量。
F. t-SNE圖顯示癌癥類型簇。
G-H. 腫瘤樣本中ESCC與EAC特異性PMD（G）以及ESCC與EAC特異性hypoDMR（H）中的ATAC-seq水平。
I-M. 點圖分別以G和H表示ATAC-seq值的量化。K–M精度召回曲線分別表示亞型特異性PMD（K）、DMR（L）或兩者（M）的平均甲基化。
研究小結(jié)
本研究強調(diào)了正常細胞類型中存在細胞類型特異性的PMDs和DMRs，這些細胞類型在惡性細胞中得以保留。本研究是首次展示PMDs在正常、前體和惡性狀態(tài)下的顯著細胞類型特異性。雖然先前的研究表明DMRs包含組織特異性的調(diào)控區(qū)域，但本研究提出了一種區(qū)分細胞類型特異性與癌癥特異性區(qū)域的方法，并利用這些方法來鑒定腫瘤特異性的調(diào)控機制。
通過區(qū)分細胞類型特異性和癌癥特異性的表觀遺傳區(qū)域，研究人員能夠更深入地理解腫瘤的調(diào)控機制，這對于癌癥的診斷、治療和預(yù)防具有重要意義。
參考文獻：
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