培養(yǎng)基(Medium)是供微生物、植物組織和動(dòng)物組織生長(zhǎng)和維持用的人工配制的養(yǎng)料,一般都含有碳水化合物、含氮物質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽(包括微量元素)以及維生素和水等。不同培養(yǎng)基可根據(jù)實(shí)際需要,添加一些自身無(wú)法合成的化合物,即生長(zhǎng)因子。培養(yǎng)基的制備程序不同類型培養(yǎng)基制備的程序也不盡相同。
培養(yǎng)基配置原則:
1.選擇適宜的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)
總體而言,所有微生物生長(zhǎng)繁殖均需要培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子、水及能源,但由于微生物營(yíng)養(yǎng)類型復(fù)雜,不同微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求是不一樣的,因此首先要根據(jù)不同微生物的營(yíng)養(yǎng)需求配制針對(duì)性強(qiáng)的培養(yǎng)基。自養(yǎng)型微生物能從簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)物合成自身需要的糖類、脂類、蛋白質(zhì)、核酸、維生素等復(fù)雜的有機(jī)物,因此培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基完全可以(或應(yīng)該)由簡(jiǎn)單的無(wú)機(jī)物組成。
就微生物主要類型而言,有細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌、原生動(dòng)物、藻類及病毒之分,培養(yǎng)它們所需的培養(yǎng)基各不相同。在實(shí)驗(yàn)室中常用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(或簡(jiǎn)稱普通肉湯培養(yǎng)基)培養(yǎng)細(xì)菌,用高氏I號(hào)合成培養(yǎng)基培養(yǎng)放線菌,培養(yǎng)酵母菌一般用麥芽汁培養(yǎng)基,培養(yǎng)霉菌則一般用查氏合成培養(yǎng)基。
2.營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度及配比合適
培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度合適時(shí)微生物才能生長(zhǎng)良好,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度過(guò)低時(shí)不能滿足微生物正常生長(zhǎng)所需,濃度過(guò)高時(shí)則可能對(duì)微生物生長(zhǎng)起抑制作用,例如高濃度糖類物質(zhì)、無(wú)機(jī)鹽、重金屬離子等不僅不能維持和促進(jìn)微生物的生長(zhǎng),反而起到抑菌或殺菌作用。
另外,培養(yǎng)基中各營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之間的濃度配比也直接影響微生物的生長(zhǎng)繁殖和(或)代謝產(chǎn)物的形成和積累,其中碳氮比(C/N)的影響較大。嚴(yán)格地講,碳氮比指培養(yǎng)基中碳元素與氮元素的物質(zhì)的量比值,有時(shí)也指培養(yǎng)基中還原糖與粗蛋白之比。
3.控制pH條件
培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的范圍內(nèi),以滿足不同類型微生物的生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。各類微生物生長(zhǎng)繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的最適pH條件各不相同,一般來(lái)講,細(xì)菌與放線菌適于在pH7-7.5范圍內(nèi)生長(zhǎng),酵母菌和霉菌通常在pH4.5-6范圍內(nèi)生長(zhǎng)。
4.控制氧化還原電位(redox potential)
不同類型微生物生長(zhǎng)對(duì)氧化還原電位(F)的要求不一樣,一般好氧性微生物在F值為+0.1V以上時(shí)可正常生長(zhǎng),一般以+0.3一+0.4V為宜,厭氧性微生物只能在F值低于+0.1V條件下生長(zhǎng),兼性厭氧微生物在F值為+0.1V以上時(shí)進(jìn)行好氧呼吸,在+0.1V以下時(shí)進(jìn)行發(fā)酵。F值與氧分壓和pH有關(guān),也受某些微生物代謝產(chǎn)物的影響。在pH相對(duì)穩(wěn)定的條件下,可通過(guò)增加通氣量(如振蕩培養(yǎng)、攪拌)提高培養(yǎng)基的氧分壓,或加入氧化劑,從而增加F值;在培養(yǎng)基中加入抗壞血酸、硫化氫、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇等還原性物質(zhì)可降低F值。
5.原料來(lái)源的選擇
在配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)盡量利用廉價(jià)且易于獲得的原料作為培養(yǎng)基成分,特別是在發(fā)酵工業(yè)中,培養(yǎng)基用量很大,利用低成本的原料更體現(xiàn)出其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
6.滅菌處理
要獲得微生物純培養(yǎng),必須避免雜菌污染,因此對(duì)所用器材及工作場(chǎng)所進(jìn)行消毒與滅菌。對(duì)培養(yǎng)基而言,更是要進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌。對(duì)培養(yǎng)基一般采取高壓蒸汽滅菌,一般培養(yǎng)基用1.05kg/cm2,121.3℃條件下維持15-30min可達(dá)到滅菌目的。
培養(yǎng)基配置的一般可分為:配料、溶化、矯正pH、澄清過(guò)濾、分裝、滅菌及檢定等8個(gè)步驟。
1,配料:按培養(yǎng)基處方準(zhǔn)確稱取各種成分,先在三角燒瓶中加入少量蒸餾水,再加入各種成分,以防蛋白胨等粘附于瓶底,然后再以剩余的水沖洗瓶壁。
2,溶化:將各種成分混勻于水中,以流通蒸氣溶化半小時(shí),如在電爐上溶化應(yīng)隨時(shí)攪拌,如有瓊脂成分時(shí)geng應(yīng)注意防止外溢。溶化完畢,補(bǔ)足失去的水分。
3,矯正pH:pH測(cè)定,取與標(biāo)準(zhǔn)管同口徑的試管(通常用華氏試管)3支,于第1、3管各加入欲測(cè)定pH的的培養(yǎng)基5ml,并于第1管中加入0.2g/L的酚紅0.25ml作為測(cè)定管,混勻醫(yī)學(xué)|教育網(wǎng)搜集整理;于第2管加入蒸餾水5ml,第4管為pH標(biāo)準(zhǔn)比色管。 pH的校正,若測(cè)定管過(guò)酸或過(guò)堿可用0.1mol/L氫氧-化鈉或0.1mol/L鹽酸溶液矯正,直至顏色與標(biāo)準(zhǔn)管相同為止,加堿或加酸時(shí)要精-確緩慢,每加1滴后要充分混勻,比色后再加第2滴(有時(shí)僅加半滴)準(zhǔn)確記錄加入的量。 計(jì)算,設(shè)5ml培養(yǎng)基矯正pH至7.4時(shí)需0.1mol/L氫氧-化鈉0.15ml,現(xiàn)有培養(yǎng)基4990ml,需加氫氧-化鈉的量可按下列方法計(jì)算:5∶4990=0.15∶X X=0.15×4990/5=149.7(ml),如將此0.1mol/L的氫氧-化鈉改用1mol/L的氫氧-化鈉時(shí),則需14.9ml即可。
4,過(guò)濾澄清:培養(yǎng)基配制后一般都有沉渣或混濁出現(xiàn),需過(guò)濾成清晰透明后方可使用,常用的過(guò)濾方法如下:
液體培養(yǎng)基必須清晰,以便觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況,常用濾紙過(guò)濾,亦可在加熱前加入用水稀釋的雞蛋白(1000ml培養(yǎng)基用1個(gè)雞蛋白)在100℃加熱后保持60~70℃40~60分鐘,使其不溶性物質(zhì)附于凝固的蛋白上而沉淀,然后再用虹吸法吸出上清液或以濾紙過(guò)濾。固體培養(yǎng)基如系瓊脂培養(yǎng)基,于加熱融化后需趁熱以絨布或兩層紗布中夾脫脂棉過(guò)濾;亦可用自然沉淀法,即將瓊脂培養(yǎng)基盛人鋁鍋或廣口搪瓷容器內(nèi),以高壓(103.43kPa)蒸汽融化15分鐘后,靜置高壓鍋內(nèi)過(guò)夜,次日將瓊脂傾出,用刀將底部沉渣切去,再融化即可收清晰的瓊脂培養(yǎng)基。
5,分裝:根據(jù)需要將培養(yǎng)基分裝于不同容量的三角燒瓶、試管中。分裝的量不宜超過(guò)容器的2/3以免滅菌時(shí)外溢。瓊脂斜面分裝量為試管容量的1/5,滅菌后須趁熱放置成斜面,斜面長(zhǎng)約為試管長(zhǎng)的2/3。半固體培養(yǎng)基分裝量約為試管長(zhǎng)的1/3,滅菌后直立凝固待用。高層瓊脂分裝量約為試管的1/3,滅菌后趁熱直立,待冷后凝固待用。液體培養(yǎng)基分裝于試管中,約是試管長(zhǎng)度的1/3。瓊脂平板:將滅菌(或加熱融化)后的培養(yǎng)基冷至50℃左右,以無(wú)菌手續(xù)傾人滅菌平皿內(nèi),內(nèi)徑9cm的平皿傾注培養(yǎng)基約13~15ml,輕搖平皿底醫(yī)學(xué)|教育網(wǎng)搜集整理,使培養(yǎng)基平鋪于平皿底部,待凝固后即成,傾注時(shí),切勿將皿蓋全部啟開,以免空氣中塵埃及細(xì)菌落入。新制成的平板培養(yǎng)基(簡(jiǎn)稱平板),表面水分較多,不利于細(xì)菌的分離,通常應(yīng)將平皿倒扣擱置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約30分鐘待平板平面干燥后使用。
6,滅菌:不同成分、性質(zhì)的培養(yǎng)基,可采用不同的滅菌方法。高壓蒸汽滅菌法:高壓滅菌的溫度與時(shí)間隨種類及數(shù)量的不同有所差別,一般少量分裝時(shí)高壓(103.43kPa)滅菌15分鐘即可,分裝量較大時(shí),可高壓(103.43kPa)滅菌30分鐘,含糖的培養(yǎng)基高壓(55.16kPa)滅菌15分鐘。以免糖類被破壞。
7,檢定:每批制成后須經(jīng)檢定方可使用,檢定時(shí)將培養(yǎng)基放37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)后,證明無(wú)菌,同時(shí)用已知菌種檢查在此培養(yǎng)基上生長(zhǎng)繁殖及生化反應(yīng)情況,符合要求者方可使用。
8,保存:制好的培養(yǎng)基,不宜保存過(guò)久,以少量勤做為宜。每批應(yīng)注明名稱,分裝量,制作日期等,放在4℃冰箱內(nèi)備用。