巨噬與腫瘤細(xì)胞之間串?dāng)_通過CXCL5/PI3K/AKT/mTOR通路抵抗胃癌化療

胃癌是最普遍的惡性腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。盡管手術(shù)前后聯(lián)合化療已被證明可以提高患者的生存率，但化療抵抗（chemoresistance）的發(fā)生仍然是獲得有效化療的主要障礙。5-FU（五氟尿嘧啶）仍然是胃癌的一線化療藥物，但化療抵抗往往出現(xiàn)導(dǎo)致臨床結(jié)果不理想。因此，更好地了解5-FU耐藥的分子機(jī)制對(duì)于改善胃癌的臨床結(jié)果至關(guān)重要。

研究表明，腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境（TME）其他成分之間的串?dāng)_促進(jìn)了化療抵抗的發(fā)展。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）構(gòu)成TME中的主要免疫細(xì)胞，TAMs分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子進(jìn)入TME，這些小蛋白是重要的調(diào)節(jié)劑，可以促進(jìn)治療耐藥性的發(fā)展。TAMs分泌的CCL2被揭示可激活乳腺癌細(xì)胞中的PI3K/AKT/mTOR通路，從而誘導(dǎo)乳腺癌對(duì)他莫昔芬治療的耐藥性。TAMs通過EMT程序調(diào)節(jié)5-FU介導(dǎo)的結(jié)直腸癌化療耐藥性，并通過釋放CCL22調(diào)節(jié)caspase-介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。基于上述研究現(xiàn)狀，可以推測TAMs分泌的細(xì)胞因子或趨化因子可能促進(jìn)胃癌化療抵抗的發(fā)展。

基于此，北京協(xié)和醫(yī)院普通外科、病理科課題組的一項(xiàng)研究曾探討了TAMs與胃癌細(xì)胞化療抵抗表型之間的相互作用。實(shí)驗(yàn)首先研究了CD68（TAMs標(biāo)志物）在接受基于5-FU的新輔助化療的胃癌患者胃癌組織中的臨床價(jià)值，并闡明了TAMs浸潤與胃癌對(duì)化療抵抗之間的相關(guān)性，此外還鑒定了一種特異性趨化因子CXCL5并進(jìn)一步研究了其潛在的分子機(jī)制與疾病預(yù)后的相關(guān)性。該研究結(jié)果揭示了TAMs與胃癌細(xì)胞之間的相互作用，提高了對(duì)TAMs如何促進(jìn)胃癌化療抵抗的認(rèn)識(shí)，并可能為化療抵抗性胃癌患者提供一種新的治療策略。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 Cancer Cell International 期刊題為“Crosstalk between tumor-associated macrophages and tumor cells promotes chemoresistance via CXCL5/PI3K/AKT/mTOR pathway in gastric cancer”。
 

首先，為了研究巨噬細(xì)胞在胃癌中的生物分布，實(shí)驗(yàn)通過免疫組化檢測了接受 5-FU 新輔助化療患者臨床樣本中巨噬細(xì)胞標(biāo)志物之一 CD68 的表達(dá)。結(jié)果顯示，與病理組相比，無病理反應(yīng)組組織中浸潤的巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加。這表明，巨噬細(xì)胞浸潤可能在胃癌化療抵抗的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。

然后通過將親本細(xì)胞連續(xù)暴露于濃度遞增的 5-FU 來建立兩種 5-FU-抵抗性胃細(xì)胞系 MKN45-R 和 HGC27-R。CCK-8 測定證實(shí)了5-FU以劑量依賴性方式降低細(xì)胞活力。此外，化療抵抗性相關(guān)蛋白P-gp和抗凋亡蛋白Bcl-2顯著升高，促凋亡蛋白Bax顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明，細(xì)胞通過長期 5-FU 的誘導(dǎo)獲得化學(xué)抵抗性。

接著將人單核細(xì)胞系THP-1分化為巨噬細(xì)胞（M0），隨后分別與MKN45-R、HGC27-R細(xì)胞及其親本細(xì)胞以非接觸式共培養(yǎng)48小時(shí)，獲得來自5-FU-敏感性TME（MS）和5-FU抵抗性TME（MR）的TAMs（圖1 A），采用RT-qPCR分析共培養(yǎng)胃細(xì)胞對(duì)M0細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，MS和MR細(xì)胞中CD86、TNF-α和IL-12等M1相關(guān)基因表達(dá)水平相對(duì)于M0細(xì)胞下調(diào)，且MR細(xì)胞的表達(dá)水平顯著低于MS細(xì)胞（圖1 B、C）。相比之下，CD163、CD206、IL-10、Arg-1和VEGF-A等M2相關(guān)基因表達(dá)水平上調(diào)，且MR細(xì)胞的表達(dá)水平明顯高于MS細(xì)胞（圖1 B、C）。此外，流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，MS和MR細(xì)胞中M1巨噬細(xì)胞的百分比降低，M2巨噬細(xì)胞百分比增加（圖1 D）。這些結(jié)果表明，胃癌細(xì)胞可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向M2樣極化，而化療抵抗細(xì)胞似乎更有效地誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為M2表型。

圖1 共培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為 M2 表型。

接下來，將胃癌細(xì)胞與不同表型的巨噬細(xì)胞在非接觸式共培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)48小時(shí)，然后清除巨噬細(xì)胞并收集胃癌細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分析（圖2 A），采用CCK-8法檢測巨噬細(xì)胞對(duì)5-FU耐藥性的影響。結(jié)果表明，與MS和MR巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)使HGC27-S細(xì)胞和MKN45-S 細(xì)胞的IC50值均增強(qiáng)（圖2 B、C）。此外，共培養(yǎng)MR巨噬細(xì)胞顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞對(duì)5-FU的抵抗性，而MS巨噬細(xì)胞的作用明顯小于MR巨噬細(xì)胞（圖2 D、E）。

然后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，與單獨(dú)培養(yǎng)或與MS巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞相比，與MR巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞的凋亡率顯著降低（圖2 F、G）。Western blot分析進(jìn)一步表明，在與MR巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞中，P-gp和Bcl-2的表達(dá)水平顯著升高，Bax顯著降低（圖2 H、I）。這些結(jié)果表明，5-FU-抵抗性胃癌細(xì)胞可以有效地誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為M2表型，這反過來又促進(jìn)胃癌細(xì)胞的5-FU-抵抗性。

圖2 共培養(yǎng)M2極化的巨噬細(xì)胞增強(qiáng)胃癌細(xì)胞5- Fu抵抗性。

進(jìn)一步地，研究人員推測MS和MR巨噬細(xì)胞增強(qiáng)胃癌細(xì)胞5-FU抵抗能力的不同可能是由于分泌的細(xì)胞因子水平不同，因此選取11種細(xì)胞因子進(jìn)行了RT-qPCR分析，發(fā)現(xiàn)只有CCL18和CXCL5的轉(zhuǎn)錄水平與以往結(jié)果的趨勢一致。與CCL18相比，MS和MR巨噬細(xì)胞中的CXCL5水平非常高，因此重點(diǎn)關(guān)注CXCL5，以驗(yàn)證其在胃癌細(xì)胞5-FU耐藥中的作用。將5-FU-敏感性胃癌細(xì)胞在存在rhCXCL5或CXCL5中和抗體下單獨(dú)培養(yǎng)或與MR巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48小時(shí)，然后用不同濃度的5-FU處理24小時(shí)評(píng)估細(xì)胞存活率。CCK-8實(shí)驗(yàn)所示，共培養(yǎng)MR巨噬細(xì)胞或添加rhCXCL5可誘導(dǎo)5-FU耐藥，而CXCL5中和抗體可降低胃癌細(xì)胞中MR巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)5-FU的耐藥性。上述結(jié)果表明，來源于M2極化巨噬細(xì)胞的CXCL5是胃癌細(xì)胞中與5-FU抵抗性相關(guān)的主要趨化因子之一。

越來越多的證據(jù)表明，對(duì)細(xì)胞凋亡的抵抗是導(dǎo)致化療抵抗的原因。5-FU主要通過介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，實(shí)驗(yàn)想要確定 M2 極化巨噬細(xì)胞是否通過調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞凋亡介導(dǎo) 5-FU-抵抗性。結(jié)果表明，共培養(yǎng)MR巨噬細(xì)胞或rhCXCL5都可以降低凋亡比例，然而應(yīng)用CXCL5中和抗體會(huì)降低MR巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡抵抗力（圖3 A、B）。Western blot分析進(jìn)一步表明，共培養(yǎng)MR巨噬細(xì)胞或添加rhCXCL5可增加Bcl-2的表達(dá)，降低Bax的表達(dá)，而CXCL5中和抗體可顯著減弱這種效應(yīng)（圖3 C、D）。既往研究表明，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和化療抵抗在腫瘤進(jìn)展中起關(guān)鍵作用�；�于此，進(jìn)一步研究了M2極化巨噬細(xì)胞對(duì)PI3K/AKT/mTOR通路激活的潛在影響，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)MR巨噬細(xì)胞和rhCXCL5均能顯著提高磷酸化的PI3K、AKT和mTOR的表達(dá)，而CXCL5中和抗體處理顯著減弱這種激活該信號(hào)通路的能力。這些數(shù)據(jù)表明，M2極化巨噬細(xì)胞來源的CXCL5可抑制細(xì)胞凋亡，激活PI3K/AKT/mTOR通路，增加胃癌細(xì)胞5-FU-抵抗性。

圖3 M2極化的巨噬細(xì)胞通過激活胃癌細(xì)胞CXCL5/PI3K/AKT/mTOR通路抑制細(xì)胞凋亡，增加5-Fu耐藥性。

最后，為了確定巨噬細(xì)胞如何影響胃癌中單核細(xì)胞的募集，進(jìn)行了趨化性測定，發(fā)現(xiàn)MR巨噬細(xì)胞的趨化誘導(dǎo)作用明顯強(qiáng)于M0和MS巨噬細(xì)胞，CXCL5中和抗體可減弱MR巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的胃癌趨化作用。采用免疫組化法檢測患者臨床標(biāo)本中CXCL5、CD163和CD206的表達(dá)，觀察到CXCL5的高表達(dá)與CD163陽性巨噬細(xì)胞和CD206陽性巨噬細(xì)胞的高浸潤相關(guān)�；�于上述數(shù)據(jù)，可以推測胃癌細(xì)胞，尤其是化療抵抗細(xì)胞可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為 M2 表型，從而導(dǎo)致 CXCL5 分泌增加。高水平的CXCL5可以反過來募集單核細(xì)胞形成更多的M2極化巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)胃癌化療抵抗微環(huán)境的發(fā)展。

然后通過免疫組化法檢測患者臨床樣本中CXCL5的表達(dá)水平分析CXCL5在胃癌患者預(yù)后的臨床相關(guān)性。CXCL5低表達(dá)和高表達(dá)的代表性圖像如圖4所示。此外，CXCL5高表達(dá)患者的總生存率（OS）顯著低于CXCL5低表達(dá)患者（圖4 B）。上述結(jié)果表明，CXCL5可作為預(yù)測胃癌化療抵抗和預(yù)后的有效生物標(biāo)志物。

圖4 CXCL5在胃癌組織中的高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)。（C）顯示巨噬細(xì)胞如何與胃癌細(xì)胞相互作用以促進(jìn)胃癌化療抵抗微環(huán)境發(fā)展的圖形摘要。

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)化療抵抗的胃癌細(xì)胞更有效地誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為M2表型，進(jìn)而反過來促進(jìn)胃癌細(xì)胞的化療抵抗性，從而在TAMs和胃癌細(xì)胞之間形成正反饋回路（圖4 C）。TAMs衍生的CXCL5在細(xì)胞間相互作用中起著關(guān)鍵作用。CXCL5可以募集單核細(xì)胞形成更多的M2極化巨噬細(xì)胞，并通過激活胃癌PI3K/AKT/mTOR通路進(jìn)一步促進(jìn)化療抵抗的發(fā)展。這些發(fā)現(xiàn)表明，靶向TAMs并阻斷TAMs與胃癌細(xì)胞之間的細(xì)胞間串?dāng)_可能代表了化療抵抗性胃癌患者的潛在治療策略。

參考文獻(xiàn)：Su P, Jiang L, Zhang Y, Yu T, Kang W, Liu Y, Yu J. Crosstalk between tumor-associated macrophages and tumor cells promotes chemoresistance via CXCL5/PI3K/AKT/mTOR pathway in gastric cancer. Cancer Cell Int. 2022 Sep 23;22(1):290. doi: 10.1186/s12935-022-02717-5. PMID: 36151545; PMCID: PMC9508748.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36151545/

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