單細胞轉錄組測序在揭示光療通過腦膜淋巴系統(tǒng)改善AD和衰老中的應用
2024年2月16日，海南大學周非凡教授和駱清銘院士為共同通訊在《nature communications》（自然通訊）雜志發(fā)表題為“Non-invasive modulation of meningeal lymphatics ameliorates ageing and Alzheimer’s disease-associated pathology and cognition in mice”的研究論文，研究利用近紅外激光（808 nm）對衰老及阿爾茨海默�。ˋlzheimer's disease, AD）小鼠進行無接觸經顱光療，利用單細胞及微量轉錄組測序（Smart-seq2）等分析揭示光療可以顯著提升腦膜淋巴系統(tǒng)的引流功能，從而實現小鼠的病理緩解及認知提升。
標題：Non-invasive modulation of meningeal lymphatics ameliorates ageing and Alzheimer’s disease-associated pathology and cognition in mice（腦膜淋巴管的非侵入性調控可改善小鼠的衰老和阿爾茨海默氏病相關的病理和認知提升）
時間：2024年2月16日
發(fā)表期刊：nature communications
影響因子：IF 16.6 / 1區(qū)
技術平臺：單細胞及微量轉錄組測序（Smart-seq2）等
研究背景：
2015年，位于硬腦膜的腦膜淋巴管（meningeal lymphatic vessels，mLVs）被發(fā)現，構成了廣泛的淋巴引流網絡，以清除大分子廢物和炎癥介質，直接免疫細胞轉運，并協調中樞神經系統(tǒng)（CNS）的免疫反應。
阿爾茨海默�。ˋD）是一種與年齡相關的神經退行性疾病，死亡率很高。AD的主要病理特征是β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）異常聚集和大腦中的神經元纏結，導致神經元功能障礙和認知能力下降。MLV 隨著年齡增長或 AD 進展而功能退化，這可能是認知功能障礙和神經損傷加劇的潛在因素。通過枕大池（intracisterna magna）內注射病毒介導的血管內皮生長因子C（VEGF-C）治療可以有效增強mLVs功能，進而增強淋巴引流以清除中樞神經系統(tǒng)中的有毒分子，并提高學習和記憶能力。因此，mLV可能是與年齡相關認知缺陷的治療靶點。然而，對于如AD等慢性和進行性神經退行性疾病，侵入性治療模式并不可行。因此，開發(fā)非侵入性治療方式對于AD治療非常必要。
mLVs 網絡淺表分布在硬腦膜中，這為經顱神經調控治療提供了一種很有前途的策略，通過 mLVs 引流調控來緩解 CNS 疾病。本研究基于組織穿透的光學窗口，證明了近紅外光可以調控腦膜淋巴內皮細胞（meningeal lymphatic endothelial cells，mLEC）功能，同時又促進mLVs引流，以緩解病理學并增強老年和AD小鼠的認知功能。本研究結果表明，光對mLECs線粒體代謝穩(wěn)態(tài)的增強可以促進細胞粘附和生長，這可能增強細胞功能和mLECs連接，以進一步促進中樞神經系統(tǒng)中的腦膜淋巴轉運以改善病理。
研究摘要：
腦膜淋巴管（MLV）參與淀粉樣蛋白β（Aβ）的清除，被認為是阿爾茨海默病（AD）的潛在治療靶點。本研究基于MLV的表層空間分布，采用近紅外光調節(jié)淋巴引流，顯著改善老年小鼠和AD（5xFAD和APP/PS1）小鼠的認知，并通過減少aβ沉積、神經炎癥和神經元損傷等來改善AD相關病理。此外透射電子顯微鏡成像和RNA測序（Smart-seq2）數據表明，通過光調節(jié)改善了腦膜淋巴管內皮細胞（MLEC）的線粒體代謝和細胞連接。這些研究共同表明，近紅外光治療可以通過恢復mLEC功能來增強MLV清除能力，從而改善認知功能。總之，光的淋巴引流增強促進了衰老和AD小鼠模型的病理緩解和認知增強，為神經退行性疾病提供了潛在的改善策略。
mLVs靶向光療改善AD病理的機制示意圖
近紅外光通過光感受器CcO增強MLEC中的線粒體代謝，CcO修復淋巴細胞連接并安排恢復MLV引流，促進廢物大分子（Aβ）清除，最終緩解小鼠神經退行性過程。
研究結果：
（1）光調節(jié) mLVs 引流并改善老年小鼠的認知能力下降：15-17個月的老年C57BL/6J小鼠實驗確定近紅外光療最佳劑量和改善認知療效
（2）光調節(jié)減輕AD小鼠的認知能力下降和病理損傷：6個月的5xFAD小鼠和11個月的APPswe/PS1ΔE9小鼠實驗證實近紅外光療可減輕AD小鼠的認知能力下降和病理損傷。
從海馬體（hippocampus，HPC）組織中提取總RNA并測序（圖2r、s，補充圖6）：
圖2：光對AD小鼠認知和病理學的改善作用。
補充圖6：光對5xFAD小鼠海馬體相關基因表達的改善效果。
a-b. 火山圖（a）和熱圖（b）顯示了光處理組與5xFAD組之間海馬體差異表達基因（DEGs）的上調和下調。
c. 熱圖顯示參與神經發(fā)生調控的DEGs的相對表達水平。
d. 比較組間海馬體組織DEGs 的KEGG富集分析。
e. 熱圖顯示參與TGF-beta信號通路的DEGs的相對表達水平。a-e數據中每組有4只小鼠。
（3）光對mLV結構的調節(jié)增強了mLV引流
（4）促進mLVs引流是光改善認知的必要條件
（5）腦膜淋巴內皮細胞（meningeal lymphatic endothelial cells，mLEC）的線粒體穩(wěn)態(tài)和細胞功能受光調節(jié)
從腦膜組織中提取總RNA并測序（圖5c-g，補充圖11）
b. mLECs線粒體長度的定量分析。每組n = 4只小鼠。
c. 光處理AD組和AD組腦膜中Nckap1l、Nck1、Calm2、Cdc42和Vegfc的表達水平。
d. 通過基因集富集分析（GSEA）的Hallmark基因組富集圖，顯示運行富集評分的輪廓和基因集成員在排序表位置。
e. 散點圖顯示線粒體氧化磷酸化富集基因，并根據Log2(FC)（FC：倍數變化）排序。
f. 光處理AD組和AD組mLECs中Lyve1、Prox1、Pecam1和Tgfa的表達。
g. 熱圖顯示參與線粒體代謝的mLECs中DEGs的相對表達水平。
每組數據n=3只小鼠（數據c-g）。b、c、f中的數據均值±SEM，并通過單因素方差分析（ANOVA）與Sidak多重比較測試進行多組比較（b），或雙尾未配對Student's t-test進行兩組比較（c, f）。
b. 通過MitoSOX熒光定量檢測mLECs中線粒體超氧化物。
c. 通過TMRE熒光定量檢測mLECs中線粒體膜電位。
d. 老年小鼠用LYVE-1、MitoSOX和TMRE染色的mLVs代表性圖像（2個生物學重復）。比例尺= 10μm。
e. 通過MitoSOX熒光定量檢測mLECs中線粒體超氧化物。
f. 通過TMRE熒光定量檢測mLECs中線粒體膜電位。b、c、e、f數據中每組n=4只小鼠。
g-h. 火山圖（g）和熱圖（h）顯示了與假手術組相比，接受光治療的5xFAD小鼠腦膜中上調和下調的差異表達基因（DEGs）。顏色比例尺值代表跨樣本的標準化對數值。
i. 相似性矩陣展示了上調的GO生物過程聚類，右側詞云包含顯著GO的過表達關鍵詞。
j-l. 比較光處理5xFAD組與5xFAD組腦膜中所有DEGs（j）、上調DEGs（k）和下調DEGs（l）的KEGG功能富集分析，通過Log10(P值)衡量。g-l數據中每組n=3只小鼠。b、c、e、f中的數據均值±SEM，并通過單因素方差分析（ANOVA）與Sidak多重比較測試進行多組比較。
從腦膜中分離出mLEC進行RNA-seq分析（補充圖12）
b-c. 5xFAD組與野生型（WT）組（b）、光處理5xFAD組與5xFAD組（c）之間mLECs的差異表達基因（DEGs）火山圖。
d-e. 5xFAD組與WT組（d）、光處理5xFAD組與5xFAD組（e）mLECs的DEGs熱圖。
f-g. 5xFAD組與WT組之間下調基因（f）、光處理5xFAD組與5xFAD組上調基因（g）的KEGG功能富集分析。
數據a-g中，WT組n=4只小鼠，5xFAD組和光處理5xFAD組n = 3只小鼠。
參考文獻：Wang M, Yan C, Li X, Yang T, Wu S, Liu Q, Luo Q, Zhou F. Non-invasive modulation of meningeal lymphatics ameliorates ageing and Alzheimer's disease-associated pathology and cognition in mice. Nat Commun. 2024 Feb 16;15(1):1453. pii: 10.1038/s41467-024-45656-7. doi: 10.1038/s41467-024-45656-7. PubMed PMID: 38365740.
標題：Non-invasive modulation of meningeal lymphatics ameliorates ageing and Alzheimer’s disease-associated pathology and cognition in mice（腦膜淋巴管的非侵入性調控可改善小鼠的衰老和阿爾茨海默氏病相關的病理和認知提升）
時間：2024年2月16日
發(fā)表期刊：nature communications
影響因子：IF 16.6 / 1區(qū)
技術平臺：單細胞及微量轉錄組測序（Smart-seq2）等
研究背景：
2015年，位于硬腦膜的腦膜淋巴管（meningeal lymphatic vessels，mLVs）被發(fā)現，構成了廣泛的淋巴引流網絡，以清除大分子廢物和炎癥介質，直接免疫細胞轉運，并協調中樞神經系統(tǒng)（CNS）的免疫反應。
阿爾茨海默�。ˋD）是一種與年齡相關的神經退行性疾病，死亡率很高。AD的主要病理特征是β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）異常聚集和大腦中的神經元纏結，導致神經元功能障礙和認知能力下降。MLV 隨著年齡增長或 AD 進展而功能退化，這可能是認知功能障礙和神經損傷加劇的潛在因素。通過枕大池（intracisterna magna）內注射病毒介導的血管內皮生長因子C（VEGF-C）治療可以有效增強mLVs功能，進而增強淋巴引流以清除中樞神經系統(tǒng)中的有毒分子，并提高學習和記憶能力。因此，mLV可能是與年齡相關認知缺陷的治療靶點。然而，對于如AD等慢性和進行性神經退行性疾病，侵入性治療模式并不可行。因此，開發(fā)非侵入性治療方式對于AD治療非常必要。
mLVs 網絡淺表分布在硬腦膜中，這為經顱神經調控治療提供了一種很有前途的策略，通過 mLVs 引流調控來緩解 CNS 疾病。本研究基于組織穿透的光學窗口，證明了近紅外光可以調控腦膜淋巴內皮細胞（meningeal lymphatic endothelial cells，mLEC）功能，同時又促進mLVs引流，以緩解病理學并增強老年和AD小鼠的認知功能。本研究結果表明，光對mLECs線粒體代謝穩(wěn)態(tài)的增強可以促進細胞粘附和生長，這可能增強細胞功能和mLECs連接，以進一步促進中樞神經系統(tǒng)中的腦膜淋巴轉運以改善病理。
研究摘要：
腦膜淋巴管（MLV）參與淀粉樣蛋白β（Aβ）的清除，被認為是阿爾茨海默病（AD）的潛在治療靶點。本研究基于MLV的表層空間分布，采用近紅外光調節(jié)淋巴引流，顯著改善老年小鼠和AD（5xFAD和APP/PS1）小鼠的認知，并通過減少aβ沉積、神經炎癥和神經元損傷等來改善AD相關病理。此外透射電子顯微鏡成像和RNA測序（Smart-seq2）數據表明，通過光調節(jié)改善了腦膜淋巴管內皮細胞（MLEC）的線粒體代謝和細胞連接。這些研究共同表明，近紅外光治療可以通過恢復mLEC功能來增強MLV清除能力，從而改善認知功能。總之，光的淋巴引流增強促進了衰老和AD小鼠模型的病理緩解和認知增強，為神經退行性疾病提供了潛在的改善策略。
mLVs靶向光療改善AD病理的機制示意圖
研究結果：
（1）光調節(jié) mLVs 引流并改善老年小鼠的認知能力下降：15-17個月的老年C57BL/6J小鼠實驗確定近紅外光療最佳劑量和改善認知療效
圖1：光對老年小鼠認知和mLVs引流的影響
（2）光調節(jié)減輕AD小鼠的認知能力下降和病理損傷：6個月的5xFAD小鼠和11個月的APPswe/PS1ΔE9小鼠實驗證實近紅外光療可減輕AD小鼠的認知能力下降和病理損傷。
從海馬體（hippocampus，HPC）組織中提取總RNA并測序（圖2r、s，補充圖6）：
圖2：光對AD小鼠認知和病理學的改善作用。
補充圖6：光對5xFAD小鼠海馬體相關基因表達的改善效果。
a-b. 火山圖（a）和熱圖（b）顯示了光處理組與5xFAD組之間海馬體差異表達基因（DEGs）的上調和下調。
c. 熱圖顯示參與神經發(fā)生調控的DEGs的相對表達水平。
d. 比較組間海馬體組織DEGs 的KEGG富集分析。
e. 熱圖顯示參與TGF-beta信號通路的DEGs的相對表達水平。a-e數據中每組有4只小鼠。
（3）光對mLV結構的調節(jié)增強了mLV引流
圖3：光對5xFAD小鼠mLV引流功能和結構變化的改善作用。
（4）促進mLVs引流是光改善認知的必要條件
圖4：光對mLVs消融小鼠認知和淋巴引流的影響
（5）腦膜淋巴內皮細胞（meningeal lymphatic endothelial cells，mLEC）的線粒體穩(wěn)態(tài)和細胞功能受光調節(jié)
從腦膜組織中提取總RNA并測序（圖5c-g，補充圖11）
圖5：光對5xFAD小鼠mLVs微觀結構和基因表達的改善作用
a. mLEC排列和線粒體形態(tài)的代表性透射電子顯微鏡（TEM）圖像（紅色箭頭：mLEC的線粒體）（2個重復）。比例尺= 2μm、500nm或200nm。b. mLECs線粒體長度的定量分析。每組n = 4只小鼠。
c. 光處理AD組和AD組腦膜中Nckap1l、Nck1、Calm2、Cdc42和Vegfc的表達水平。
d. 通過基因集富集分析（GSEA）的Hallmark基因組富集圖，顯示運行富集評分的輪廓和基因集成員在排序表位置。
e. 散點圖顯示線粒體氧化磷酸化富集基因，并根據Log2(FC)（FC：倍數變化）排序。
f. 光處理AD組和AD組mLECs中Lyve1、Prox1、Pecam1和Tgfa的表達。
g. 熱圖顯示參與線粒體代謝的mLECs中DEGs的相對表達水平。
每組數據n=3只小鼠（數據c-g）。b、c、f中的數據均值±SEM，并通過單因素方差分析（ANOVA）與Sidak多重比較測試進行多組比較（b），或雙尾未配對Student's t-test進行兩組比較（c, f）。
補充圖11：光對5xFAD小鼠腦膜基因表達的改善效果。
a. 5xFAD小鼠用LYVE-1、線粒體超氧化物指示劑（MitoSOX）和四甲基羅丹明（TMRE）染色的mLVs代表性圖像（2個生物學重復）。比例尺 = 10μm。b. 通過MitoSOX熒光定量檢測mLECs中線粒體超氧化物。
c. 通過TMRE熒光定量檢測mLECs中線粒體膜電位。
d. 老年小鼠用LYVE-1、MitoSOX和TMRE染色的mLVs代表性圖像（2個生物學重復）。比例尺= 10μm。
e. 通過MitoSOX熒光定量檢測mLECs中線粒體超氧化物。
f. 通過TMRE熒光定量檢測mLECs中線粒體膜電位。b、c、e、f數據中每組n=4只小鼠。
g-h. 火山圖（g）和熱圖（h）顯示了與假手術組相比，接受光治療的5xFAD小鼠腦膜中上調和下調的差異表達基因（DEGs）。顏色比例尺值代表跨樣本的標準化對數值。
i. 相似性矩陣展示了上調的GO生物過程聚類，右側詞云包含顯著GO的過表達關鍵詞。
j-l. 比較光處理5xFAD組與5xFAD組腦膜中所有DEGs（j）、上調DEGs（k）和下調DEGs（l）的KEGG功能富集分析，通過Log10(P值)衡量。g-l數據中每組n=3只小鼠。b、c、e、f中的數據均值±SEM，并通過單因素方差分析（ANOVA）與Sidak多重比較測試進行多組比較。
從腦膜中分離出mLEC進行RNA-seq分析（補充圖12）
補充圖12：光對5xFAD小鼠mLECs基因表達的改善效果。
a. 代表性圖表顯示通過熒光激活細胞分選（FACS）從不同組小鼠腦膜中分離mLECs的門控策略。b-c. 5xFAD組與野生型（WT）組（b）、光處理5xFAD組與5xFAD組（c）之間mLECs的差異表達基因（DEGs）火山圖。
d-e. 5xFAD組與WT組（d）、光處理5xFAD組與5xFAD組（e）mLECs的DEGs熱圖。
f-g. 5xFAD組與WT組之間下調基因（f）、光處理5xFAD組與5xFAD組上調基因（g）的KEGG功能富集分析。
數據a-g中，WT組n=4只小鼠，5xFAD組和光處理5xFAD組n = 3只小鼠。
參考文獻：Wang M, Yan C, Li X, Yang T, Wu S, Liu Q, Luo Q, Zhou F. Non-invasive modulation of meningeal lymphatics ameliorates ageing and Alzheimer's disease-associated pathology and cognition in mice. Nat Commun. 2024 Feb 16;15(1):1453. pii: 10.1038/s41467-024-45656-7. doi: 10.1038/s41467-024-45656-7. PubMed PMID: 38365740.
標簽：
DNA甲基化
