DAP-seq助力揭示轉(zhuǎn)錄因子在草地貪夜蛾Bt抗性中重要作用

2024年4月6日，武漢生物工程學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院劉磊磊課題組在International Journal of Biological Macromolecules（中科院一區(qū)，影響因子8.2）期刊在線發(fā)表了“Contribution of the transcription factor SfGATAe to Bt Cry toxin resistance in Spodoptera frugiperda through reduction of ABCC2 expression”的研究論文。該團隊利用DAP-seq等技術(shù)闡明了轉(zhuǎn)錄因子SfGATAe對毒素受體基因SfABCC2表達的調(diào)控機制，并全面闡釋了這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制對草地貪夜蛾Bt抗性產(chǎn)生的重要影響。這項研究為探索SfGATAe在抗性機制中的作用，并為開發(fā)以SfGATAe為靶點的生物農(nóng)藥奠定了重要理論基礎(chǔ)。

ABCC2轉(zhuǎn)運蛋白屬于多次跨膜蛋白，其不同情況的突變能引起機體對Bt毒素不同程度的抗性，SfABCC2轉(zhuǎn)運蛋白介導(dǎo)的草地貪夜蛾對Bt毒素抗性研究具有重要的意義。而鱗翅目昆蟲中特異性毒素受體的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控與昆蟲Bt抗性關(guān)系知之甚少，GATA轉(zhuǎn)錄因子屬于鋅指蛋白家族，包含位于 NH₂ 末端區(qū)域的轉(zhuǎn)錄激活域、兩個高度保守的鋅指區(qū)域、一個核定位信號序列和一個未知功能的 COOH 末端域， GATAe 通過調(diào)節(jié)中腸組織特異性基因的表達，參與中腸干細(xì)胞的發(fā)育和分化。

圖1草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞系中的亞細(xì)胞定位分析 

該研究團隊運用了DAP-seq技術(shù)，以高通量、高分辨率的鑒定了SfGATAe的直接轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點。該研究共識別出了19,740個結(jié)合峰，其中1,507個位點位于啟動區(qū)。該研究通過構(gòu)建一系列截短載體，并利用雙熒光素報告系統(tǒng)評估了每個構(gòu)建對報告基因的驅(qū)動能力，并成功鑒定了調(diào)控元件的關(guān)鍵區(qū)域。通過酵母單雜交實驗、DNA pull down和定點突變等實驗，確定了轉(zhuǎn)錄因子SfGATAe在ABCC2靶基因中的核心控制位點。

圖2 SfGATAe 與ABCC2受體啟動子結(jié)合關(guān)鍵區(qū)域鑒定

圖3 SfGATAe結(jié)合啟動子區(qū)的DNA基序鑒定

轉(zhuǎn)錄因子SfGATAe在草地貪夜蛾時空表達分析表明，SfGATAe的在中腸表達水平都顯著高于非中腸器官，中腸中SfGATAe的增強表達可能表明其參與調(diào)節(jié)昆蟲代謝或解毒過程，尤其在調(diào)控Cry1Ac毒素受體ABCC2方面的重要作用。

圖4 SfGATAe在草地貪夜蛾不同發(fā)育階段和各部位時空表達模式

SfGATAe表達水平降低導(dǎo)致SfABCC2受體表達減少，進而導(dǎo)致幼蟲對Cry1Ac毒素的敏感性降低。SfGATAe與SfABCC2基因啟動子內(nèi)的關(guān)鍵結(jié)合位點的結(jié)合調(diào)節(jié)了SfABCC2蛋白的表達。SfGATAe在腸道內(nèi)表現(xiàn)出高水平表達，敲降SfGATAe表達，幼蟲體內(nèi)SfABCC2的表達降低。該研究加強了對鱗翅目害蟲中ABCC2的后轉(zhuǎn)錄調(diào)控的理解，為進一步探索SfGATAe在調(diào)控Cry1Ac和其他殺蟲劑抗性機制中的功能奠定基礎(chǔ)。

圖5 抑制SfGATAe表達量減少ABCC2表達水平導(dǎo)致草地貪夜蛾對Bt抗性