小鼠模型助力揭示人線粒體tRNAt6A修飾對線粒體基因表達調(diào)控的作用

tRNA在所有核酸分子中含有最多的轉(zhuǎn)錄后修飾，這些化學(xué)修飾對于穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)和功能十分重要。其中N6-蘇氨�；�甲腺苷酸（t⁶A）修飾高度保守，發(fā)生在幾乎所有生物體和細胞器解碼ANN(N=A, T, G, C)密碼子的tRNA的37位腺嘌呤上。人線粒體tRNA上的t⁶A修飾由OSGEPL1和YRDC共同負責(zé)合成，但這一修飾在哺乳動物線粒體mRAN翻譯過程中發(fā)揮的作用尚不完全清楚。

2024年1月，中國科學(xué)院分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心周小龍/王恩多團隊在Nucleic Acids Research發(fā)表了題為“Multifaceted roles of t⁶A biogenesis in efficiency and fidelity of mitochondrial gene expression”的文章。分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心周小龍研究員和王恩多研究員為本文的共同通訊作者。分子細胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心博士研究生張勇，周敬波為該論文的共同第一作者。
 

圖片來源：《Nucleic Acids Research》
（https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkae013/7560177）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員構(gòu)建了人OSGEPL1敲除細胞系以及Osgepl1全身敲除小鼠模型（由賽業(yè)生物提供）。此外，研究人員還運用了慢病毒在KO細胞中穩(wěn)定表達了野生型及突變體OSGEPL1。該研究中作者采用了高效液相色譜-質(zhì)譜檢測技術(shù)（LC-MS/MS），BN-PAGE，Northern blot，心臟超聲等實驗技術(shù)。

技術(shù)路線
01 構(gòu)建OSGEPL1敲除細胞
02 發(fā)現(xiàn)t⁶A的缺失會導(dǎo)致其他修飾水平發(fā)生變化
03 t⁶A的缺失導(dǎo)致線粒體tRNA氨基�；�及翻譯準確性受到影響
04 穩(wěn)定表達OSGEPL1可以回補上述缺陷
05 通過構(gòu)建Osgepl1全身敲除的小鼠研究其對心臟功能產(chǎn)生的影響

研究結(jié)果
1 t⁶A37低修飾導(dǎo)致hmtRNA^Thr和hmtRNA^Lys中m¹A9和m²G10水平增加
本研究中，研究人員通過CRISPR-Cas9技術(shù)在HEK293T細胞上構(gòu)建了敲除OSGEPL1的KO細胞系，首次發(fā)現(xiàn)t⁶A修飾的缺失會協(xié)同調(diào)控mt-tRNA^Thr和mt-tRNA^Lys上第9位1-甲基腺嘌呤（m¹A）和第10位2-甲基鳥嘌呤（m²G）的上調(diào)。這可能是由于TRMT10C啟動子活性增強使其mRNA水平升高并最終導(dǎo)致TRMT10C蛋白質(zhì)水平的升高，進而使m¹A9修飾水平上調(diào)。同時，t⁶A修飾的缺失也會導(dǎo)致這兩種tRNA的氨基�；�水平下調(diào)。
 

t⁶A37低修飾導(dǎo)致hmtRNA^Thr和hmtRNA^Lys中m¹A9和m²G10水平增加^[1]

2 t⁶A37低修飾導(dǎo)致線粒體mRNA翻譯過程中出現(xiàn)多種氨基酸錯誤摻入
通過分離線粒體氧化磷酸化超復(fù)合物并進行質(zhì)譜分析，研究人員發(fā)現(xiàn)t⁶A修飾的缺失會使臨近37位的36位反密碼子“A”錯誤識別其他堿基并導(dǎo)致多種線粒體遺傳密碼解碼錯誤。線粒體翻譯效率及精確性的下降導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化復(fù)合物表達及活力的減弱并進一步導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)及功能的異常和線粒體UPR的激活。
 

t⁶A37低修飾導(dǎo)致線粒體mRNA翻譯過程中出現(xiàn)多種氨基酸錯誤摻入^[1]

3 Osgepl1基因敲除小鼠線粒體基因組編碼蛋白質(zhì)翻譯受損但是未對心臟產(chǎn)生顯著影響
通過構(gòu)建Osgepl1全身敲除的小鼠（由賽業(yè)生物提供），研究人員重點研究了該模型小鼠的心臟功能。發(fā)現(xiàn)Osgepl1-KO小鼠心臟線粒體編碼的Mt-Cox2和Mt-Cox3的表達量顯著下降，然而即使在20月齡模型小鼠的心臟功能檢測中，這兩種線粒體編碼氧化磷酸化復(fù)合物IV蛋白質(zhì)表達量的下調(diào)并未顯著影響小鼠的心臟線粒體氧化磷酸化復(fù)合物的組裝，心臟超聲顯示其射血分數(shù)、短軸收縮率以及每搏心輸出量未發(fā)生顯著變化，同時其壽命也未受到顯著影響。
 

Osgepl1基因敲除小鼠線粒體基因組編碼蛋白質(zhì)翻譯受損但是未對心臟產(chǎn)生顯著影響^[1]

研究結(jié)論
該研究首次發(fā)現(xiàn)了線粒體tRNA 37位t⁶A修飾缺失會導(dǎo)致mt-tRNA^Thr和mt-tRNA^Lys上m¹A9，m²G10修飾的異常升高及氨基�；�下降；同時發(fā)現(xiàn)該修飾的缺失導(dǎo)致其五種底物tRNA會錯誤地與mRNA配對使翻譯精確性下降。這些功能紊亂共同導(dǎo)致線粒體功能和結(jié)構(gòu)的異常。但在動物層面上t⁶A修飾缺失未對小鼠心臟功能及壽命產(chǎn)生顯著影響。以上結(jié)果加深了人們對線粒體tRNA修飾的生物學(xué)功能的認識。

參考文獻：
[1]Yong Zhang, Jing-Bo Zhou, Yue Yin, En-Duo Wang, Xiao-Long Zhou, Multifaceted roles of t6A biogenesis in efficiency and fidelity of mitochondrial gene expression, Nucleic Acids Research, 2024;, gkae013, https://doi.org/10.1093/nar/gkae013

Osgepl1 KO小鼠

小鼠福利，限定發(fā)放中~

品系名稱：
C57BL/6NCya-Osgepl1^em1/Cya
產(chǎn)品編號：
S-KO-13824
應(yīng)用方向：
眼科,代謝,遺傳,肝臟,腎臟,罕見病
 

Osgepl1 flox小鼠

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品系名稱：
C57BL/6JCya-Osgepl1^em1flox/Cya
產(chǎn)品編號：
S-CKO-15344
應(yīng)用方向：
眼科,代謝,遺傳,肝臟,腎臟,罕見病