細(xì)胞攻略：NCI-H2170(人肺鱗癌細(xì)胞)培養(yǎng)教程

--細(xì) 胞 基 本 信 息---
細(xì)胞名稱： NCI-H2170(人肺鱗癌細(xì)胞)
細(xì)胞別稱： H2170; H-2170; NCIH2170
細(xì)胞貨號(hào)： SNL-579
生長特性： 貼壁
培養(yǎng)條件： 1640+10% FBS+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境： 37℃；5% CO2；飽和濕度
細(xì)胞簡介： NCI-H2170[H2170]細(xì)胞是1989年4月建系的，是從患有鱗狀細(xì)胞癌的非吸煙男性患者的肺中分離的細(xì)胞系。
   
NCI-H2170細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)：
 
1. 貼壁較慢
傳代或復(fù)蘇之后，NCI-H2170細(xì)胞需要較長時(shí)間才能完全貼壁。起初細(xì)胞可能成簇貼壁，隨著培養(yǎng)細(xì)胞會(huì)慢慢鋪展開形成單層細(xì)胞。建議將細(xì)胞接種至培養(yǎng)器皿后，放進(jìn)培養(yǎng)箱耐心等待48小時(shí)再拿出培養(yǎng)瓶觀察，更有利于細(xì)胞貼壁。

• 細(xì)胞呈島狀/片狀生長

這是NCI-H2170細(xì)胞的特性，是正�，F(xiàn)象，并不是細(xì)胞發(fā)生“聚團(tuán)”，無需擔(dān)心。細(xì)胞間連接緊密，在70%~80%密度時(shí)細(xì)胞實(shí)際數(shù)量其實(shí)很大，此時(shí)需要傳代。

• 細(xì)胞生長較慢

80%密度1：2傳代的情況下，傳代周期為6天左右，需耐心培養(yǎng)。維持2-3天換液一次，少觀察少操作，保持細(xì)胞生長環(huán)境穩(wěn)定。建議每次傳代按1：2傳，接種密度不可過低。

• 存在漂浮細(xì)胞

NCI-H2170細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)存在部分漂浮的細(xì)胞是正常現(xiàn)象，不影響貼壁細(xì)胞生長。復(fù)蘇和傳代初期，漂浮的細(xì)胞可能較多，培養(yǎng)過程中也會(huì)存在漂浮細(xì)胞，當(dāng)貼壁細(xì)胞密度較低時(shí)，應(yīng)該在換液時(shí)將漂浮細(xì)胞離心收集并接種回原瓶，這些漂浮細(xì)胞仍有可能貼壁。當(dāng)貼壁細(xì)胞較多時(shí)，漂浮細(xì)胞可以舍棄。

• 黑點(diǎn)較多

NCI-H2170細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)背景中可能有較多黑點(diǎn)，為細(xì)胞代謝產(chǎn)物和細(xì)胞碎片，不影響細(xì)胞生長。若黑點(diǎn)較多可以在換液時(shí)用預(yù)熱的PBS輕輕潤洗。
 
NCI-H2170細(xì)胞傳代攻略

• 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、胰酶、PBS、離心管、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等；（試劑提前預(yù)熱）
• 先盡量吸干凈T25瓶原培養(yǎng)基，再加5mL 常溫PBS輕輕潤洗細(xì)胞10-20s，吸走潤洗的PBS；
• T25瓶加1mL 0.25%胰酶（含EDTA），輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶以使胰酶鋪勻瓶底細(xì)胞層，將培養(yǎng)瓶放入37度培養(yǎng)箱消化；
• 消化到細(xì)胞明顯回縮，間隙變大，但未完全脫落時(shí)加2-3mL完全培養(yǎng)基終止胰酶消化；

Tips：

• 如果您無法準(zhǔn)確掌控胰酶作用時(shí)間，建議按照下述操作：胰酶首先復(fù)溫到室溫，PBS潤洗細(xì)胞后，將胰酶加入細(xì)胞，放入37度培養(yǎng)箱，然后每隔1min拿出觀察一次，可用手掌輕拍1-2下培養(yǎng)瓶側(cè)邊（請(qǐng)勿用力拍打），如果部分細(xì)胞開始自然滑落，說明細(xì)胞消化完成，加完全培養(yǎng)基終止消化，否則再等1min重復(fù)操作直至細(xì)胞能夠自然滑落。（保證細(xì)胞是被消化下來的，而不是被強(qiáng)行吹下或拍下的）

• 混勻細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心3min；
• 在新的培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；（T25推薦10mL，T75推薦20mL）
• 離心完成后，棄上清，加入適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸吹散細(xì)胞，將細(xì)胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中，十字法或8字法混勻，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，注意培養(yǎng)瓶蓋透氣。

 
Tips：

• 推薦傳代比例1：2，細(xì)胞生長至80%密度時(shí)即可傳代。
• 建議傳代后24h再觀察細(xì)胞，若有漂浮死細(xì)胞，可通過換液去除
• 控制吹打力度輕柔，吹打次數(shù)不能過多（建議每次重懸吹打不超過10次）

 
NCI-H2170細(xì)胞凍存攻略

• 配制程序性凍存液，準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量凍存管并做好標(biāo)記。

Tips：推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完全培養(yǎng)基+8%DMSO

• 先將細(xì)胞按傳代步驟獲得細(xì)胞沉淀；
• 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中；
• 將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；
• 轉(zhuǎn)移凍存細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置。

Tips：

• 液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測(cè)凍存細(xì)胞的活性，若活性合格即可長期保存。
• 程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液請(qǐng)按產(chǎn)品說明書處理降溫過程。
• T25培養(yǎng)瓶長滿通常可凍存2-3管，10cm皿長滿通�？蓛龃�3-4管。
• 凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)不佳。

 
NCI-H2170細(xì)胞復(fù)蘇攻略

• 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃，培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃，離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速；
• 將細(xì)胞從液氮罐中取出，觀察管內(nèi)無液氮的情況下，捏住管蓋，將細(xì)胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃，細(xì)胞融化至米粒大小冰塊時(shí)終止水浴，融化過程不超過2min；

Tips：

• 若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn)，細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至細(xì)胞房。
• 凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細(xì)胞時(shí)震動(dòng)不要過大。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮，若有液氮需靜置一會(huì)待液氮完全蒸發(fā)后再水浴。做好防護(hù)，避免凍存管炸開導(dǎo)致受傷。
• 水浴時(shí)使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染。  
• 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min，不同離心機(jī)具體轉(zhuǎn)速會(huì)有差異
• 離心完成后棄上清，用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管，輕柔重懸細(xì)胞后接種至培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱；
• 復(fù)蘇24小時(shí)后觀察細(xì)胞貼壁情況。

Tips：整個(gè)細(xì)胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。
 
NCI-H2170細(xì)胞收貨攻略

• 常溫細(xì)胞

• 收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上；
• 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL，顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片，觀察細(xì)胞密度，若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代（首次傳代比例建議1：2），若細(xì)胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

Tips：若收貨時(shí)發(fā)現(xiàn)懸浮細(xì)胞較多，應(yīng)離心收集懸浮細(xì)胞并放回原瓶

• 凍存細(xì)胞

• 細(xì)胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復(fù)蘇）短期保存或液氮中長期保存，若干冰完全揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷售人員解決；
• 凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查，以免超出售后期，復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略；
• 復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時(shí)聯(lián)系銷售人員，在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進(jìn)行下一步操作；

Tips：

• 細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完全揮發(fā)等異常情況時(shí)，及時(shí)拍照聯(lián)系銷售人員；
• 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對(duì)應(yīng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)；  

 
常見問題及解決方案
NO.1細(xì)胞密度怎么計(jì)算的？
嚴(yán)格意義上，細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，但在實(shí)際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計(jì)數(shù)。因此，常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對(duì)于最大生長密度的比值，貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個(gè)細(xì)胞生長不同密度時(shí)所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn)，但也是相當(dāng)直觀、簡便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式；
 
NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理？
1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細(xì)胞都會(huì)有這種現(xiàn)象，只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別，細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞，消化完成后加完全培養(yǎng)基終止消化，混勻細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清。再加5mL PBS重懸細(xì)胞，再離心后，用完全培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時(shí)碎片比較少，傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次。
 
NO.3細(xì)胞具體消化時(shí)間是多久？
每個(gè)客戶用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能完全規(guī)定消化時(shí)間，以實(shí)際消化效果和客戶經(jīng)驗(yàn)為準(zhǔn)。 
 
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