PROTAC體外DMPK研究一站式產(chǎn)品解決方案
小分子藥物因?yàn)槠淇煽诜母弑憷裕孜�、易穿透�?xì)胞膜的高可成藥性，成為現(xiàn)代藥物開發(fā)的基石。但傳統(tǒng)的小分子藥物采用的是“占位驅(qū)動”模式來抑制蛋白功能，導(dǎo)致包括受體、激酶及通道類型等靶點(diǎn)在內(nèi)的基因僅有約400種可作目標(biāo)藥物，而已知的可成藥的基因約3000種。因此，“事件驅(qū)動”模式蛋白降解靶向嵌合體（Proteolysis-Targeting Chimera, PROTAC）技術(shù)為新藥研發(fā)提供了新思路，并成為新藥研發(fā)的一大利器。
一、蛋白降解靶向嵌合體簡介
PROTAC是一種異雙功能分子，結(jié)構(gòu)由兩個配體通過Linker連接而成，其中一個配體可結(jié)合目標(biāo)蛋白（Protein of interest, POI），另一個配體可以靶向E3連接酶。其本質(zhì)是存在于所有真核生物中的天然蛋白降解機(jī)制——泛素-蛋白酶體途徑（Ubiquitin-Proteasome Pathway, UPP）。該途徑涉及一個三酶級聯(lián)反應(yīng)，即泛素分子在泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）及泛素連接酶（E3）等系列酶作用下，將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分類并選中靶蛋白，并對靶蛋白進(jìn)行特異性修飾，最終形成靶蛋白多聚泛素鏈并被蛋白酶體識別和降解。其中，E1激活酶和E2結(jié)合酶參與的過程稱為泛素的激活，單獨(dú)的泛素本身并沒有任何生物功能，只是一種分子標(biāo)記蛋白，發(fā)揮作用的前提是必須有ATP來提供能量。
因此，PROTAC是一種“事件驅(qū)動”的模式，即它可以和靶蛋白任何位置結(jié)合，且不需要高親和力，就可以誘導(dǎo)靶蛋白降解。PROTACA分子在進(jìn)入細(xì)胞后，其目標(biāo)蛋白配體可特異性結(jié)合靶蛋白，另一端可募集E3連接酶，最終形成POI-Linker-E3 Ligase三元復(fù)合物，拉近E3連接酶和靶蛋白的距離，從而誘導(dǎo)E3連接酶為靶蛋白貼上泛素標(biāo)簽，繼而促進(jìn)靶蛋白的降解。隨著靶蛋白降解而掉落下來的PROTAC分子可繼續(xù)被循環(huán)利用。
二、蛋白降解靶向嵌合體體外研究難點(diǎn)
盡管PROTAC因其獨(dú)特作用機(jī)制具有突破性的優(yōu)勢，但PROTAC分子的開發(fā)仍面臨大量挑戰(zhàn)。
口服給藥是大多數(shù)疾病治療的理想給藥方式，但PROTAC由于其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)并不滿足“分子量小于500；氫鍵供體數(shù)目小于5；氫鍵受體數(shù)目小于10；脂水分配系數(shù)小于5和可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量不超過10個”的經(jīng)典小分子藥物類藥五原則。PROTAC分子量通常在600~1200 Da之間，一般可達(dá)到700 Da以上，且一般伴有溶解性較差、體內(nèi)外滲透性表現(xiàn)不佳，口服生物利用度通常偏低及吸收較差等情況。
此外，相較于暴露量越多越好的傳統(tǒng)小分子藥物來說，PROTAC由于結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，具有新的挑戰(zhàn)。通常，在合適的或相對較低的濃度下，PROTAC可誘導(dǎo)靶蛋白和E3連接酶形成“靶蛋白PROTAC-E3連接酶”三元復(fù)合物；然而，當(dāng)濃度過高時(shí)，就易競爭性地出現(xiàn)“靶蛋白-PROTAC”或“E3連接酶-PROTAC”等二元復(fù)合物，即“鉤子效應(yīng)”，導(dǎo)致藥效降低甚至出現(xiàn)毒性積累。因此，適時(shí)地調(diào)整PROTAC劑量對于靶向治療至關(guān)重要。
目前現(xiàn)有研究表明PROTAC分子在各種屬中均呈現(xiàn)較高的血漿蛋白結(jié)合狀態(tài)，常規(guī)的血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)可能無法準(zhǔn)確的體現(xiàn)其血漿蛋白結(jié)合率，而血漿蛋白結(jié)合率的測定是必須的。血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)可測定化合物在血漿中的穩(wěn)定性，以防止化合物在高血漿蛋白結(jié)合率的情況下出現(xiàn)藥物代謝過緩并導(dǎo)致化合物不被清除的現(xiàn)象。同時(shí)，PROTAC分子本身結(jié)構(gòu)特殊，分子量大，為提高其滲透性與溶解度，在藥物設(shè)計(jì)時(shí)往往需要引入雜原子，且Linker部分在代謝層面其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生可能發(fā)生藥物毒性作用或藥效不足的現(xiàn)象，因此，對PROTAC分子代謝產(chǎn)物的鑒定至關(guān)重要。
而根據(jù)《藥物相互作用研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，了解轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的藥物相互作用也是評價(jià)體外藥代動力學(xué)的重要內(nèi)容之一。早期常采用Caco2細(xì)胞、高表達(dá)BCRP細(xì)胞或高表達(dá)BCRP膜囊泡進(jìn)行體外評估，然而由于PROTAC分子結(jié)構(gòu)的特殊性，其滲透性一般較差，采用完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)可能低估PROTAC分子對外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制作用。
綜上所述，對PROTAC分子進(jìn)行體外DMPK研究至關(guān)重要，然而，目前尚無定項(xiàng)針對PROTAC藥物研究的指導(dǎo)原則，因此，在實(shí)際研究中，研究者往往會參照小分子藥物研究的指導(dǎo)原則。
三、PROTAC體外研究策略
盡管PROTAC是一種暫無指導(dǎo)原則的新興小分子藥物，但它“事件驅(qū)動模式”的功效性促使藥物研發(fā)領(lǐng)頭軍們對其展開了孜孜不倦的研究。目前國內(nèi)部分藥企對PROTAC分子藥物的開發(fā)已接近國際水平并達(dá)到了臨床階段。
圖片來源：clinicaltrials, chinadrugtrials,太平洋證券整理
目前常規(guī)檢測化合物的溶解度通常是利用PH 7.4的磷酸緩沖液，但已有研究報(bào)道PROTAC分子在不同狀態(tài)下（禁食/非禁食）的腸液中其溶解度顯著不同，即在腸液中PROTAC分子溶解度相對更高，且非禁食狀態(tài)下的溶解度效果優(yōu)于禁食狀態(tài)的腸液。針對滲透性研究，PROTAC分子的研究遵循了常見的體外模型結(jié)構(gòu)，即可利用Caco2、MDCK和LLC-PK1等模型。
而為防止“鉤子效應(yīng)”、確定血漿蛋白結(jié)合率和代謝產(chǎn)物等情況，對PROTAC分子進(jìn)行體外代謝研究是至關(guān)重要的！PROTAC分子體外DMPK研究一般也遵循小分子藥物的研究方式，即了解PROTAC藥物的代謝關(guān)鍵酶、選擇合適的體外模型及測定其血漿穩(wěn)定性等。
確定代謝關(guān)鍵酶
對PROTAC進(jìn)行體外藥代動力學(xué)研究，除了基本的I相（CYP酶）代謝和II相（UGT酶）代謝，已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)醛氧化酶（Aldehyde oxidase, AOX）可參與PROTAC分子的代謝，但存在明顯的種屬差異，需要多種屬驗(yàn)證確保數(shù)據(jù)真實(shí)性。
全血/血漿穩(wěn)定性試驗(yàn)
作為體外藥代動力學(xué)早期研究的試驗(yàn)之一，全血中含有豐富的水解酶類，可催化藥物的水解代謝，且根據(jù)經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，全血中不穩(wěn)定的化合物一般含有酰胺鍵、磺酰胺鍵、肽鍵及酯鍵等官能團(tuán)，由此可進(jìn)一步推斷導(dǎo)致PROTAC在全血中不穩(wěn)定性的位置的可能性。
血漿蛋白結(jié)合率測定
已知PROTAC分子在各種屬中均呈現(xiàn)較高的血漿蛋白結(jié)合狀態(tài)，所以對其進(jìn)行種屬間比較或體外-體內(nèi)外推（in vitro-in vivo extrapolation, IVIVE）時(shí)需充分考慮化合物在孵育體系中的游離率和全血中游離率數(shù)據(jù)。
鑒于PROTAC分子溶解性對外排轉(zhuǎn)運(yùn)體研究的影響性，采用高表達(dá)BCRP膜囊泡模型更具說服力，即膜囊泡可使ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物結(jié)合位點(diǎn)暴露于細(xì)胞外緩沖液中，更適用于研究候選藥物作為底物和抑制劑與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的相互作用。
四、IPHASE體外DMPK研究“一站式”產(chǎn)品解決方案
IPHASE作為體外研究生物試劑引領(lǐng)者，緊隨藥物開發(fā)前沿，針對PROTAC分子藥物體外DMPK研究方向，研發(fā)了多種類、多層次、多領(lǐng)域的體外生物試劑，助力PROTAC藥物臨床前階段研究！
IPHASE/匯智和源憑借多年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，推出了多領(lǐng)域、多種類的高端科研試劑，為藥物早期研發(fā)提供篩選工具，為生命科學(xué)領(lǐng)域的探索提供新材料、新方法和新手段，為食品、藥品、化學(xué)品等的遺傳毒性研究提供便捷產(chǎn)品，望廣大科研工作者來電咨詢，咨詢熱線400-127-6686。
參考文獻(xiàn):
[1] 藥明康德，《藥物代謝與動力學(xué)：前沿、策略與應(yīng)用實(shí)例》。
[2] Churcher, I., 2018. Protac-Induced Protein Degradation in Drug Discovery: Breaking the Rules or Just Making New Ones? Journal of Medicinal Chemistry 61, 444–452.
[3] Békés M, Langley DR, Crews CM. PROTAC targeted protein degraders: the past is prologue[J]. Nat Rev Drug Discov. 2022 Mar;21(3):181-200.
[4] Goracci L , Desantis J , Valeri A , et al. Understanding the Metabolism of Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs): The Next Step toward Pharmaceutical Applications[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2020, 63(20):11615–11638.
[5] 《藥物相互作用研究技術(shù)指導(dǎo)原則》。
匯智和源，致力于為創(chuàng)新藥研發(fā)企業(yè)及生命科學(xué)研究機(jī)構(gòu)提供高品質(zhì)的生物試劑，IPHASE為公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。
一、蛋白降解靶向嵌合體簡介
PROTAC是一種異雙功能分子，結(jié)構(gòu)由兩個配體通過Linker連接而成，其中一個配體可結(jié)合目標(biāo)蛋白（Protein of interest, POI），另一個配體可以靶向E3連接酶。其本質(zhì)是存在于所有真核生物中的天然蛋白降解機(jī)制——泛素-蛋白酶體途徑（Ubiquitin-Proteasome Pathway, UPP）。該途徑涉及一個三酶級聯(lián)反應(yīng)，即泛素分子在泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）及泛素連接酶（E3）等系列酶作用下，將細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分類并選中靶蛋白，并對靶蛋白進(jìn)行特異性修飾，最終形成靶蛋白多聚泛素鏈并被蛋白酶體識別和降解。其中，E1激活酶和E2結(jié)合酶參與的過程稱為泛素的激活，單獨(dú)的泛素本身并沒有任何生物功能，只是一種分子標(biāo)記蛋白，發(fā)揮作用的前提是必須有ATP來提供能量。
圖片來源：Autophagy and the ubiquitin-proteasome system: collaborators in neuroprotection.
因此，PROTAC是一種“事件驅(qū)動”的模式，即它可以和靶蛋白任何位置結(jié)合，且不需要高親和力，就可以誘導(dǎo)靶蛋白降解。PROTACA分子在進(jìn)入細(xì)胞后，其目標(biāo)蛋白配體可特異性結(jié)合靶蛋白，另一端可募集E3連接酶，最終形成POI-Linker-E3 Ligase三元復(fù)合物，拉近E3連接酶和靶蛋白的距離，從而誘導(dǎo)E3連接酶為靶蛋白貼上泛素標(biāo)簽，繼而促進(jìn)靶蛋白的降解。隨著靶蛋白降解而掉落下來的PROTAC分子可繼續(xù)被循環(huán)利用。
圖片來源：Discovery of a first-in-class CDK2 selective degrader for AML differentiation therapy
二、蛋白降解靶向嵌合體體外研究難點(diǎn)
盡管PROTAC因其獨(dú)特作用機(jī)制具有突破性的優(yōu)勢，但PROTAC分子的開發(fā)仍面臨大量挑戰(zhàn)。
口服給藥是大多數(shù)疾病治療的理想給藥方式，但PROTAC由于其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)并不滿足“分子量小于500；氫鍵供體數(shù)目小于5；氫鍵受體數(shù)目小于10；脂水分配系數(shù)小于5和可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量不超過10個”的經(jīng)典小分子藥物類藥五原則。PROTAC分子量通常在600~1200 Da之間，一般可達(dá)到700 Da以上，且一般伴有溶解性較差、體內(nèi)外滲透性表現(xiàn)不佳，口服生物利用度通常偏低及吸收較差等情況。
此外，相較于暴露量越多越好的傳統(tǒng)小分子藥物來說，PROTAC由于結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，具有新的挑戰(zhàn)。通常，在合適的或相對較低的濃度下，PROTAC可誘導(dǎo)靶蛋白和E3連接酶形成“靶蛋白PROTAC-E3連接酶”三元復(fù)合物；然而，當(dāng)濃度過高時(shí)，就易競爭性地出現(xiàn)“靶蛋白-PROTAC”或“E3連接酶-PROTAC”等二元復(fù)合物，即“鉤子效應(yīng)”，導(dǎo)致藥效降低甚至出現(xiàn)毒性積累。因此，適時(shí)地調(diào)整PROTAC劑量對于靶向治療至關(guān)重要。
目前現(xiàn)有研究表明PROTAC分子在各種屬中均呈現(xiàn)較高的血漿蛋白結(jié)合狀態(tài)，常規(guī)的血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)可能無法準(zhǔn)確的體現(xiàn)其血漿蛋白結(jié)合率，而血漿蛋白結(jié)合率的測定是必須的。血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)可測定化合物在血漿中的穩(wěn)定性，以防止化合物在高血漿蛋白結(jié)合率的情況下出現(xiàn)藥物代謝過緩并導(dǎo)致化合物不被清除的現(xiàn)象。同時(shí)，PROTAC分子本身結(jié)構(gòu)特殊，分子量大，為提高其滲透性與溶解度，在藥物設(shè)計(jì)時(shí)往往需要引入雜原子，且Linker部分在代謝層面其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生可能發(fā)生藥物毒性作用或藥效不足的現(xiàn)象，因此，對PROTAC分子代謝產(chǎn)物的鑒定至關(guān)重要。
而根據(jù)《藥物相互作用研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，了解轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的藥物相互作用也是評價(jià)體外藥代動力學(xué)的重要內(nèi)容之一。早期常采用Caco2細(xì)胞、高表達(dá)BCRP細(xì)胞或高表達(dá)BCRP膜囊泡進(jìn)行體外評估，然而由于PROTAC分子結(jié)構(gòu)的特殊性，其滲透性一般較差，采用完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)可能低估PROTAC分子對外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的抑制作用。
綜上所述，對PROTAC分子進(jìn)行體外DMPK研究至關(guān)重要，然而，目前尚無定項(xiàng)針對PROTAC藥物研究的指導(dǎo)原則，因此，在實(shí)際研究中，研究者往往會參照小分子藥物研究的指導(dǎo)原則。
三、PROTAC體外研究策略
盡管PROTAC是一種暫無指導(dǎo)原則的新興小分子藥物，但它“事件驅(qū)動模式”的功效性促使藥物研發(fā)領(lǐng)頭軍們對其展開了孜孜不倦的研究。目前國內(nèi)部分藥企對PROTAC分子藥物的開發(fā)已接近國際水平并達(dá)到了臨床階段。
圖片來源：clinicaltrials, chinadrugtrials,太平洋證券整理
目前常規(guī)檢測化合物的溶解度通常是利用PH 7.4的磷酸緩沖液，但已有研究報(bào)道PROTAC分子在不同狀態(tài)下（禁食/非禁食）的腸液中其溶解度顯著不同，即在腸液中PROTAC分子溶解度相對更高，且非禁食狀態(tài)下的溶解度效果優(yōu)于禁食狀態(tài)的腸液。針對滲透性研究，PROTAC分子的研究遵循了常見的體外模型結(jié)構(gòu)，即可利用Caco2、MDCK和LLC-PK1等模型。
而為防止“鉤子效應(yīng)”、確定血漿蛋白結(jié)合率和代謝產(chǎn)物等情況，對PROTAC分子進(jìn)行體外代謝研究是至關(guān)重要的！PROTAC分子體外DMPK研究一般也遵循小分子藥物的研究方式，即了解PROTAC藥物的代謝關(guān)鍵酶、選擇合適的體外模型及測定其血漿穩(wěn)定性等。
確定代謝關(guān)鍵酶
對PROTAC進(jìn)行體外藥代動力學(xué)研究，除了基本的I相（CYP酶）代謝和II相（UGT酶）代謝，已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)醛氧化酶（Aldehyde oxidase, AOX）可參與PROTAC分子的代謝，但存在明顯的種屬差異，需要多種屬驗(yàn)證確保數(shù)據(jù)真實(shí)性。
全血/血漿穩(wěn)定性試驗(yàn)
作為體外藥代動力學(xué)早期研究的試驗(yàn)之一，全血中含有豐富的水解酶類，可催化藥物的水解代謝，且根據(jù)經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，全血中不穩(wěn)定的化合物一般含有酰胺鍵、磺酰胺鍵、肽鍵及酯鍵等官能團(tuán)，由此可進(jìn)一步推斷導(dǎo)致PROTAC在全血中不穩(wěn)定性的位置的可能性。
血漿蛋白結(jié)合率測定
已知PROTAC分子在各種屬中均呈現(xiàn)較高的血漿蛋白結(jié)合狀態(tài)，所以對其進(jìn)行種屬間比較或體外-體內(nèi)外推（in vitro-in vivo extrapolation, IVIVE）時(shí)需充分考慮化合物在孵育體系中的游離率和全血中游離率數(shù)據(jù)。
常見的體外代謝研究模型如下：
鑒于PROTAC分子溶解性對外排轉(zhuǎn)運(yùn)體研究的影響性，采用高表達(dá)BCRP膜囊泡模型更具說服力，即膜囊泡可使ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物結(jié)合位點(diǎn)暴露于細(xì)胞外緩沖液中，更適用于研究候選藥物作為底物和抑制劑與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的相互作用。
四、IPHASE體外DMPK研究“一站式”產(chǎn)品解決方案
IPHASE作為體外研究生物試劑引領(lǐng)者，緊隨藥物開發(fā)前沿，針對PROTAC分子藥物體外DMPK研究方向，研發(fā)了多種類、多層次、多領(lǐng)域的體外生物試劑，助力PROTAC藥物臨床前階段研究！
| 產(chǎn)品類別 | 組分分類 | 名稱 |
| 亞細(xì)胞組分試劑 | 肝微粒體 | 人/猴/犬/兔/大鼠/小鼠/地鼠/貓/小型豬 微粒體 |
| 肝S9 | 人/猴/犬/大鼠/小鼠/小型豬 S9 | |
| 肝胞質(zhì)液 | 人/猴/犬/大鼠/小鼠/小型豬 胞質(zhì)液 | |
| 原代肝細(xì)胞產(chǎn)品 | / | 人/猴/犬/大鼠/小鼠/小型豬 懸浮/貼壁原代肝細(xì)胞 |
| 轉(zhuǎn)運(yùn)體產(chǎn)品 | ABC 家族轉(zhuǎn)運(yùn)體 | 人類BCRP/BSEP/MDR1/MRP1/MRP2/MRP3/MRP4/MRP8 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體 |
| SLC 家族轉(zhuǎn)運(yùn)體 | 人類 OATP1B1/OAT1/OAT3/OCT2/ OATP1B3/OATP2B1/OCT1/NTCP/MATE1/MATE2K/OATP1A2 SLC轉(zhuǎn)運(yùn)體細(xì)胞 |
|
| 重組酶產(chǎn)品 | CYP | 人CYP 1A2+/2A6+/2B6+/2C8+/2C9+/2C19+/2D6+/2E1+/3A4+/1A1+/3A5+ 還原重組酶 |
| UGT | 人UGT 1A1/1A3/1A4/1A6/1A7/1A8/1A9/1A10/2B7/2B15/2B17 重組酶 | |
| 血漿相關(guān)產(chǎn)品 | 血漿蛋白結(jié)合試劑 | 人/猴/犬/大鼠/小鼠血漿蛋白結(jié)合試劑 |
| 平衡透析裝置 | 血漿蛋白結(jié)合試驗(yàn)平衡透析裝置 | |
| 平衡透析膜 | ||
| 血漿穩(wěn)定性試驗(yàn)產(chǎn)品 | 人/猴/犬/大鼠/小鼠 空白血漿（穩(wěn)定性專用）/全血 | |
| 緩沖液 | / | PH 7.4 磷酸緩沖液 |
IPHASE/匯智和源憑借多年的研發(fā)經(jīng)驗(yàn)，推出了多領(lǐng)域、多種類的高端科研試劑，為藥物早期研發(fā)提供篩選工具，為生命科學(xué)領(lǐng)域的探索提供新材料、新方法和新手段，為食品、藥品、化學(xué)品等的遺傳毒性研究提供便捷產(chǎn)品，望廣大科研工作者來電咨詢，咨詢熱線400-127-6686。
參考文獻(xiàn):
[1] 藥明康德，《藥物代謝與動力學(xué)：前沿、策略與應(yīng)用實(shí)例》。
[2] Churcher, I., 2018. Protac-Induced Protein Degradation in Drug Discovery: Breaking the Rules or Just Making New Ones? Journal of Medicinal Chemistry 61, 444–452.
[3] Békés M, Langley DR, Crews CM. PROTAC targeted protein degraders: the past is prologue[J]. Nat Rev Drug Discov. 2022 Mar;21(3):181-200.
[4] Goracci L , Desantis J , Valeri A , et al. Understanding the Metabolism of Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs): The Next Step toward Pharmaceutical Applications[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2020, 63(20):11615–11638.
[5] 《藥物相互作用研究技術(shù)指導(dǎo)原則》。
匯智和源，致力于為創(chuàng)新藥研發(fā)企業(yè)及生命科學(xué)研究機(jī)構(gòu)提供高品質(zhì)的生物試劑，IPHASE為公司核心品牌，品牌宗旨“Innovative Reagents For Innovative Research”。
Copyright(C) 1998-2024 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com