細(xì)菌內(nèi)毒素定量光度測(cè)定法操作規(guī)程與有效性評(píng)估指南
瀏覽次數(shù):785 發(fā)布日期:2024-6-21
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一、概述
細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法(定量檢測(cè))之光度測(cè)定法是一種利用光譜分析技術(shù)來測(cè)定樣品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法。此方法依賴于鱟試劑(一種從鱟的血液中提取的生物試劑,對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素高度敏感)與內(nèi)毒素反應(yīng)產(chǎn)生的濁度變化,通過比色法量化內(nèi)毒素水平。
二、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
材料準(zhǔn)備:用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素配成溶液,并制成至少3個(gè)不同濃度的稀釋液,稀釋度不得大于10,最低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測(cè)限。
試驗(yàn)設(shè)置:每一稀釋步驟的混勻時(shí)間同凝膠法,每一濃度至少做3支平行管。同時(shí)設(shè)置2支陰性對(duì)照。
數(shù)據(jù)分析:當(dāng)陰性對(duì)照在設(shè)定的時(shí)間內(nèi)不發(fā)生反應(yīng)時(shí),對(duì)全部數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(r)的絕對(duì)值應(yīng)大于或等于0.980,否則需重新試驗(yàn)。
三、光度測(cè)定法操作步驟
溶液準(zhǔn)備:選擇標(biāo)準(zhǔn)線中點(diǎn)或一個(gè)靠近中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度,制備溶液A、B、C和D。
加樣與保溫:參照所用儀器和試劑的有關(guān)說明,確定供試品和鱟試劑的加樣量、比例以及保溫時(shí)間。每種溶液至少做2個(gè)平行管。
檢測(cè)與計(jì)算:使用溶液C生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算溶液A的每一平行管的內(nèi)毒素濃度。通過溶液B和A的濃度差計(jì)算內(nèi)毒素的回收率,確保其在50%-200%的范圍內(nèi)。
四、試驗(yàn)有效性判定
標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性:系列溶液C的結(jié)果需符合標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)要求。
回收率:用溶液B中的內(nèi)毒素濃度減去溶液A中的內(nèi)毒素濃度后,計(jì)算出的內(nèi)毒素的回收率應(yīng)在50%-200%的范圍內(nèi)。
陰性對(duì)照:溶液D(陰性對(duì)照)在規(guī)定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)未檢測(cè)出內(nèi)毒素。
供試品判定:若供試品溶液所在平行管的平均內(nèi)毒素濃度乘以稀釋倍數(shù)和濃度后,小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值,則判供試品符合規(guī)定;若大于規(guī)定的內(nèi)毒素限值,則判供試品不符合規(guī)定。
五、注意事項(xiàng)
嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范,確保試驗(yàn)環(huán)境的潔凈和穩(wěn)定。
使用經(jīng)細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)驗(yàn)證合格的無熱原器具,以減少干擾和誤差。
遵循所有關(guān)于內(nèi)毒素旋渦震蕩次數(shù)的建議,確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。
定期對(duì)儀器進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn),以保證其性能的穩(wěn)定和準(zhǔn)確。
這種方法是藥品、醫(yī)療器械及生物制品安全性評(píng)估中不可或缺的一部分,確保產(chǎn)品無細(xì)菌內(nèi)毒素污染,保障患者安全。