DAP-seq技術(shù)助力揭示MdWRKY75調(diào)控蘋果耐熱性的分子機(jī)制

2024年6月12日，西北農(nóng)林科技大學(xué)作物抗逆與高效生產(chǎn)全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/園藝學(xué)院蘋果抗逆與品質(zhì)改良創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)馬鋒旺教授/李超課題組在植物學(xué)知名期刊The Plant Cell（影響因子10）在線發(fā)表了題為“The MdHSC70-MdWRKY75 module mediates basal apple thermotolerance by regulating the expression of heat shock factor genes”的研究論文，揭示了MdHSC70-MdWRKY75模塊調(diào)控MdHsfs參與蘋果耐熱性的新機(jī)制。

蘋果（Malus × domestica）是世界上最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的水果之一，對(duì)人類健康和促進(jìn)我國北方農(nóng)民增收、鄉(xiāng)村振興及生態(tài)環(huán)境改善等方面發(fā)揮重要作用。我國是世界上最大的蘋果生產(chǎn)和消費(fèi)國，但大多數(shù)蘋果產(chǎn)區(qū)夏季高溫，導(dǎo)致蘋果生長(zhǎng)發(fā)育不良，嚴(yán)重制約了蘋果產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)高效發(fā)展。因此，挖掘和鑒定蘋果耐熱基因，探究蘋果熱脅迫的調(diào)控機(jī)制，能夠?yàn)樘O果耐熱分子設(shè)計(jì)育種提供理論依據(jù)和基因資源，對(duì)全球氣候變暖背景下蘋果產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

在該研究中，作者首先發(fā)現(xiàn)MdWRKY75的表達(dá)受熱脅迫誘導(dǎo)上調(diào)。隨后，作者通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得了MdWRKY75過表達(dá)和干擾蘋果植株，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行高溫處理后發(fā)現(xiàn)，MdWRKY75正調(diào)節(jié)蘋果耐熱性（圖1）。

圖1 MdWRKY75正調(diào)控蘋果耐熱性

通過RNA-seq、DAP-seq（圖2）以及RT-qPCR試驗(yàn)篩選到MdWRKY75在熱脅迫下的5個(gè)潛在靶基因。EMSA、酵母單雜交、GUS和雙熒光素酶試驗(yàn)證明MdWRKY75正調(diào)控?zé)峒まD(zhuǎn)錄因子MdHsf4、MdHsfB2a和MdHsfA1d的表達(dá)。通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)證明這三個(gè)熱激轉(zhuǎn)錄因子均正調(diào)節(jié)蘋果耐熱性。在MdWRKY75-Ri3的背景下對(duì)這三個(gè)MdHsfs進(jìn)行過表達(dá)均能挽救其熱敏感表型，說明MdWRKY75的耐熱性是通過激活這三個(gè)熱激轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

圖2 DAP-seq鑒定了MdWRKY75在全基因組上的結(jié)合情況及識(shí)別位點(diǎn)

隨后，作者通過酵母雙雜交篩庫篩選到與MdWRKY75互作的熱激蛋白MdHSC70。分別通過瞬時(shí)過表達(dá)和VIGS技術(shù)證明MdHSC70是蘋果耐熱性的負(fù)調(diào)節(jié)因子。GUS、雙熒光素酶和EMSA試驗(yàn)證明MdHSC70通過與MdWRKY75互作并抑制其對(duì)MdHsfs的激活作用。在MdWRKY75-OE3的背景下分別對(duì)MdHSC70進(jìn)行瞬時(shí)過表達(dá)和沉默后發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)MdHSC70顯著降低了MdWRKY75-OE3的耐熱性，而沉默MdHSC70的植株耐熱性與MdWRKY75-OE3無顯著差異，表明MdHSC70的熱敏表型是由MdWRKY75介導(dǎo)的。

綜上所述，該研究明確了MdWRKY75通過激活MdHsfs的表達(dá)正調(diào)控蘋果耐熱性的生物學(xué)功能，闡明了MdHSC70與MdWRKY75互作并抑制其對(duì)MdHsfs調(diào)控的分子機(jī)制（圖3）。研究結(jié)果豐富了蘋果應(yīng)對(duì)高溫環(huán)境的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，也為蘋果的分子定向育種提供基因資源和理論基礎(chǔ)。

圖3 MdHSC70-MdWRKY75-MdHsfs模塊調(diào)節(jié)蘋果耐熱性的分子機(jī)制