WGBS+RNA-seq揭示PM2.5引起男性生殖障礙的DNA甲基化調(diào)控機(jī)制
2022年09月24日，陸軍醫(yī)科大學(xué)（第三軍醫(yī)大學(xué)）預(yù)防醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)研究所張中豪博士等為第一作者，曹佳教授、劉晉祎教授為通訊作者以" Genome-wide alternation and effect of DNA methylation in the impairments of steroidogenesis and spermatogenesis after PM2.5 exposure"為題在《Environment International》雜志發(fā)表研究論文。該研究通過對小鼠睪丸組織的全基因組重亞硫酸鹽測序（Whole gene bisulfite sequencing,WGBS）與對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）聯(lián)合分析，鑒定出與類固醇生成和精子發(fā)生過程相關(guān)的關(guān)鍵基因和通路，揭示了PM2.5導(dǎo)致男性生殖障礙的潛在DNA甲基化調(diào)控機(jī)制。
標(biāo)題：Genome-wide alternation and effect of DNA methylation in the impairments of steroidogenesis and spermatogenesis after PM2.5 exposure（PM2.5暴露后類固醇生成和精子生成障礙的全基因組DNA甲基化變化和效應(yīng)）
發(fā)表期刊：Environment International
發(fā)表日期：2022年09月24日
影響因子：IF 13.352
技術(shù)：全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）、轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）、蛋白質(zhì)印記
樣品：8周齡C57BL/6雄性小鼠，分為過濾空氣組（filtered air group ,FA），未過濾空氣組（unfiltered air group ,UA）和濃縮PM2.5組(concentrated ambient PM2.5 group, CAP)。每組2個(gè)重復(fù)，共6個(gè)樣本。
摘要
環(huán)境細(xì)顆粒物（PM2.5）對男性生殖健康的影響已引起廣泛關(guān)注，其損害的具體潛在機(jī)制仍不清楚，需要在新的方向進(jìn)行更多研究。先前研究表明，DNA甲基化在男性生殖發(fā)育中起著重要作用，也易受環(huán)境影響，然而對于DNA甲基化參與PM2.5誘導(dǎo)的男性生殖毒性作用還沒有足夠研究。為此，本研究建立一個(gè)實(shí)時(shí)PM2.5暴露模型，揭示了PM2.5暴露可能導(dǎo)致睪丸功能障礙，包括精子發(fā)生障礙和類固醇激素功能障礙。睪丸5-甲基胞嘧啶（5mC）全基因組水平降低表明DNA甲基化可能與PM2.5暴露誘導(dǎo)的睪丸損傷有關(guān)。進(jìn)一步的全基因組甲基化分析揭示了睪丸DNA的基因組低甲基化，并在CAP組與UA組和FA組中發(fā)現(xiàn)1000多個(gè)差異甲基化區(qū)域（DMR），表明PM2.5暴露（即使低劑量）可以調(diào)控睪丸甲基化。此外，甲基化組和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析鑒定出一些關(guān)鍵甲基化基因和網(wǎng)絡(luò)，這些基因和網(wǎng)絡(luò)可能參與精子發(fā)生和類固醇激素的合成。關(guān)鍵基因尤其是Cyp11a1和Pax8的睪丸甲基化水平升高，隨后表達(dá)水平降低可能會損害睪酮和精子生成過程。本研究為DNA甲基化可能參與PM2.5誘導(dǎo)的男性生殖損傷提供了基礎(chǔ)知識和新見解。
圖形摘要
睪丸全基因組DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析鑒定了與類固醇生成和精子發(fā)生過程相關(guān)的關(guān)鍵基因和通路，這可能是PM2.5引起的男性生殖障礙中DNA甲基化調(diào)控機(jī)制。
研究思路
材料方法
8周齡C57BL/6雄性小鼠，過濾空氣組（FA），未過濾空氣組（UA）和濃縮PM2.5 組(CAP)。FA組為高效顆�？諝膺^濾器過濾的環(huán)境空氣，UA組為未經(jīng)過濾的環(huán)境空氣，CAP組為細(xì)顆粒物（PM2.5）暴露環(huán)境空氣。
從小鼠眼眶叢中獲得血液，稱重睪丸和附睪，分別固定在Bouin溶液中進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析和在液氮中速凍-80°C儲存。
從睪丸組織中分離提取RNA、DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行全基因組重亞硫酸鹽測序 （WGBS）分析、轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）和Western Blot實(shí)驗(yàn)，WGBS為每組構(gòu)建兩個(gè)庫，每個(gè)庫包含來自四只小鼠的合并睪丸DNA。
研究結(jié)果
（1）PM2.5暴露導(dǎo)致精子質(zhì)量下降和精子發(fā)生損傷
圖2：PM2.5暴露導(dǎo)致精子發(fā)生障礙
（A）睪丸的典型病理圖像。三角形（基底膜中斷），黑色箭頭（空泡化）。
（B-C）在VII期曲細(xì)精管（n=15）中檢測曲細(xì)精管直徑（B）和上皮高度（C）的精子發(fā)生參數(shù)。
（D-H）每個(gè)VII期曲細(xì)精管的Sertoli細(xì)胞（D）、精原細(xì)胞（E）、粗線期精母細(xì)胞（F）、圓形精子細(xì)胞（G）和總生殖細(xì)胞（H）的計(jì)數(shù)（n=15）。
（I-L）精原細(xì)胞/Sertoli細(xì)胞比率（I）、粗線期精母細(xì)胞/Sertoli細(xì)胞比率（J）、圓形精母細(xì)胞/Sertoli細(xì)胞比率（K）、總生殖細(xì)胞/Sertali細(xì)胞比率（L）（n=15）。
單向方差分析，然后Tukey多重比較。與FA處理組相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001。
（2）PM2.5暴露誘發(fā)睪丸類固醇激素功能障礙
（D）血清T/LH在血清中的比值（D）（n=15）。
（E-G）睪丸水平，睪酮(T)（E）、LH（F）、FSH（G）（n=7）。
（H） 睪丸T/LH比值（n=7）。
（3）PM2.5暴露誘導(dǎo)睪丸全基因組低甲基化
（B） 基因組甲基化測序示意圖。
（C） 通過WGBS檢測睪丸基因組中所有CpG位點(diǎn)的全基因組DNA甲基化水平。
（D） 功能基因組區(qū)域mm10內(nèi)5mC相對密度的基因組特征。
（E） PM2.5暴露組與FA組DMR鑒定。
（F和H） CAP組（F）和UA組（H）染色體上的顯著DMR。
（G和I） CAP組（G）和UA組（I）中鑒定的DMR基因組位置（啟動子、5’UTR、外顯子、內(nèi)含子、3’UTR、基因間）（上：高DMR；下：低DMR）。
（J） DMR相關(guān)基因（DMG）生物過程的富集分析。點(diǎn)的顏色表示P值，點(diǎn)的大小是給定生物過程中的富集分?jǐn)?shù)。
（4）基于DMR的功能相關(guān)基因
（B） 與FA組相比，CAP組中PDMGs的最高生物過程（top biological process）氣泡圖。每個(gè)圓圈表示不同的生物過程，大小表示富集-sore。X軸表示總差異基因中高甲基化和低甲基化基因數(shù)量差異比例。氣泡越向右，表示通路中高甲基化基因比例就越高。
（C） 啟動子區(qū)域的DMG以及染色體位置的曼哈頓圖。X軸代表染色體。Y軸是-log10 FDR。
（D） DNA甲基化peaks可視化Meioc基因座。橙色表示DMR區(qū)域。
（5）PM2.5暴露破壞了睪丸的轉(zhuǎn)錄組特征
（B） FA組、UA組和CAP組中DEG熱圖。
（C） DEG的KEGG分析。
（D） FA組和CAP組中類固醇激素生物合成過程基因組的GSEA分析。
（E） 睪酮生物合成通路分子圖。
（F） 與類固醇生成和精子發(fā)生相關(guān)的DEGs熱圖。塊的顏色表示每組的基因表達(dá)水平。
（6）DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析，鑒定與PM2.5暴露相關(guān)的關(guān)鍵甲基化基因
（B） 參與生殖功能的候選基因網(wǎng)絡(luò)。
（C） RT-PCR驗(yàn)證睪丸中候選類固醇生成相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平（n=6）。
（D） RT-PCR驗(yàn)證睪丸中候選精子發(fā)生相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平（n=6）。
（E） Cyp11a1基因DMR內(nèi)代表性CpG甲基化譜。
（F） Pax8基因DMR內(nèi)代表性CpG甲基化譜。
（G） western blot分析睪丸候選基因的蛋白表達(dá)水平。
（H） CYP11A1和PAX8的蛋白質(zhì)定量分析（n=6）。
結(jié)論：
本研究表明PM2.5暴露可導(dǎo)致睪丸功能障礙，包括精子發(fā)生和類固醇激素功能障礙。作者揭示了PM2.5可以改變睪丸的甲基化水平，表明DNA甲基化可能參與PM2.5誘導(dǎo)的男性生殖損傷過程。睪丸全基因組DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析鑒定了與類固醇生成和精子發(fā)生過程相關(guān)的關(guān)鍵基因和通路，這可能是PM2.5導(dǎo)致男性生殖障礙的DNA甲基化調(diào)控機(jī)制。本研究可能為PM2.5誘導(dǎo)男性生殖毒性的潛在表觀遺傳機(jī)制提供重要信息和新視角。
參考文獻(xiàn)：Zhang Z, Wang J, Shi F, Li Y, Zou P, Tang Y, Liu C, Wang Y, Ling X, Sun L, Liu C, Zhang Y, Gao F, Chen Q, Ao L, Han F, Liu J, Cao J. Genome-wide alternation and effect of DNA methylation in the impairments of steroidogenesis and spermatogenesis after PM2.5 exposure. Environ Int. 2022 Sep 24;169:107544.
標(biāo)題：Genome-wide alternation and effect of DNA methylation in the impairments of steroidogenesis and spermatogenesis after PM2.5 exposure（PM2.5暴露后類固醇生成和精子生成障礙的全基因組DNA甲基化變化和效應(yīng)）
發(fā)表期刊：Environment International
發(fā)表日期：2022年09月24日
影響因子：IF 13.352
技術(shù)：全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）、轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）、蛋白質(zhì)印記
樣品：8周齡C57BL/6雄性小鼠，分為過濾空氣組（filtered air group ,FA），未過濾空氣組（unfiltered air group ,UA）和濃縮PM2.5組(concentrated ambient PM2.5 group, CAP)。每組2個(gè)重復(fù)，共6個(gè)樣本。
摘要
環(huán)境細(xì)顆粒物（PM2.5）對男性生殖健康的影響已引起廣泛關(guān)注，其損害的具體潛在機(jī)制仍不清楚，需要在新的方向進(jìn)行更多研究。先前研究表明，DNA甲基化在男性生殖發(fā)育中起著重要作用，也易受環(huán)境影響，然而對于DNA甲基化參與PM2.5誘導(dǎo)的男性生殖毒性作用還沒有足夠研究。為此，本研究建立一個(gè)實(shí)時(shí)PM2.5暴露模型，揭示了PM2.5暴露可能導(dǎo)致睪丸功能障礙，包括精子發(fā)生障礙和類固醇激素功能障礙。睪丸5-甲基胞嘧啶（5mC）全基因組水平降低表明DNA甲基化可能與PM2.5暴露誘導(dǎo)的睪丸損傷有關(guān)。進(jìn)一步的全基因組甲基化分析揭示了睪丸DNA的基因組低甲基化，并在CAP組與UA組和FA組中發(fā)現(xiàn)1000多個(gè)差異甲基化區(qū)域（DMR），表明PM2.5暴露（即使低劑量）可以調(diào)控睪丸甲基化。此外，甲基化組和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析鑒定出一些關(guān)鍵甲基化基因和網(wǎng)絡(luò)，這些基因和網(wǎng)絡(luò)可能參與精子發(fā)生和類固醇激素的合成。關(guān)鍵基因尤其是Cyp11a1和Pax8的睪丸甲基化水平升高，隨后表達(dá)水平降低可能會損害睪酮和精子生成過程。本研究為DNA甲基化可能參與PM2.5誘導(dǎo)的男性生殖損傷提供了基礎(chǔ)知識和新見解。
圖形摘要
睪丸全基因組DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析鑒定了與類固醇生成和精子發(fā)生過程相關(guān)的關(guān)鍵基因和通路，這可能是PM2.5引起的男性生殖障礙中DNA甲基化調(diào)控機(jī)制。
研究思路
材料方法
8周齡C57BL/6雄性小鼠，過濾空氣組（FA），未過濾空氣組（UA）和濃縮PM2.5 組(CAP)。FA組為高效顆�？諝膺^濾器過濾的環(huán)境空氣，UA組為未經(jīng)過濾的環(huán)境空氣，CAP組為細(xì)顆粒物（PM2.5）暴露環(huán)境空氣。
從小鼠眼眶叢中獲得血液，稱重睪丸和附睪，分別固定在Bouin溶液中進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析和在液氮中速凍-80°C儲存。
從睪丸組織中分離提取RNA、DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行全基因組重亞硫酸鹽測序 （WGBS）分析、轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）和Western Blot實(shí)驗(yàn)，WGBS為每組構(gòu)建兩個(gè)庫，每個(gè)庫包含來自四只小鼠的合并睪丸DNA。
圖1：PM2.5暴露表征
（A）PM2.5暴露程序示意圖。（B）實(shí)驗(yàn)期間各組PM2.5濃度。（C） PM2.5中無機(jī)離子水平。（D）PM2.5中多環(huán)芳烴濃度。（E）PM2.5中痕量金屬（trace metal）濃度。研究結(jié)果
（1）PM2.5暴露導(dǎo)致精子質(zhì)量下降和精子發(fā)生損傷
圖2：PM2.5暴露導(dǎo)致精子發(fā)生障礙
（B-C）在VII期曲細(xì)精管（n=15）中檢測曲細(xì)精管直徑（B）和上皮高度（C）的精子發(fā)生參數(shù)。
（D-H）每個(gè)VII期曲細(xì)精管的Sertoli細(xì)胞（D）、精原細(xì)胞（E）、粗線期精母細(xì)胞（F）、圓形精子細(xì)胞（G）和總生殖細(xì)胞（H）的計(jì)數(shù)（n=15）。
（I-L）精原細(xì)胞/Sertoli細(xì)胞比率（I）、粗線期精母細(xì)胞/Sertoli細(xì)胞比率（J）、圓形精母細(xì)胞/Sertoli細(xì)胞比率（K）、總生殖細(xì)胞/Sertali細(xì)胞比率（L）（n=15）。
單向方差分析，然后Tukey多重比較。與FA處理組相比，P<0.05，P<0.01，P<0.001。
（2）PM2.5暴露誘發(fā)睪丸類固醇激素功能障礙
圖3：PM2.5暴露誘發(fā)睪丸內(nèi)分泌功能障礙
（A-C）血清中的激素。睪酮(T)（A）、促黃體生成素(LH)（B）、卵泡刺激素(FSH)（C）的水平（D）血清T/LH在血清中的比值（D）（n=15）。
（E-G）睪丸水平，睪酮(T)（E）、LH（F）、FSH（G）（n=7）。
（H） 睪丸T/LH比值（n=7）。
（3）PM2.5暴露誘導(dǎo)睪丸全基因組低甲基化
圖4：PM2.5暴露改變了睪丸中的甲基化模式
（A） ELISA檢測到的睪丸DNA的全基因組5mC甲基化水平。（B） 基因組甲基化測序示意圖。
（C） 通過WGBS檢測睪丸基因組中所有CpG位點(diǎn)的全基因組DNA甲基化水平。
（D） 功能基因組區(qū)域mm10內(nèi)5mC相對密度的基因組特征。
（E） PM2.5暴露組與FA組DMR鑒定。
（F和H） CAP組（F）和UA組（H）染色體上的顯著DMR。
（G和I） CAP組（G）和UA組（I）中鑒定的DMR基因組位置（啟動子、5’UTR、外顯子、內(nèi)含子、3’UTR、基因間）（上：高DMR；下：低DMR）。
（J） DMR相關(guān)基因（DMG）生物過程的富集分析。點(diǎn)的顏色表示P值，點(diǎn)的大小是給定生物過程中的富集分?jǐn)?shù)。
（4）基于DMR的功能相關(guān)基因
圖5：PM2.5誘導(dǎo)的啟動子相關(guān)DMR變化表征
（A） FA組、UA組和CAP組中啟動子連接的DMR相關(guān)基因（PDMG）熱圖。塊的顏色表示相對甲基化水平。紅色表示高甲基化，藍(lán)色表示低甲基化。（B） 與FA組相比，CAP組中PDMGs的最高生物過程（top biological process）氣泡圖。每個(gè)圓圈表示不同的生物過程，大小表示富集-sore。X軸表示總差異基因中高甲基化和低甲基化基因數(shù)量差異比例。氣泡越向右，表示通路中高甲基化基因比例就越高。
（C） 啟動子區(qū)域的DMG以及染色體位置的曼哈頓圖。X軸代表染色體。Y軸是-log10 FDR。
（D） DNA甲基化peaks可視化Meioc基因座。橙色表示DMR區(qū)域。
（5）PM2.5暴露破壞了睪丸的轉(zhuǎn)錄組特征
圖6：PM2.5暴露破壞睪丸的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征
（A） 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)圖。（B） FA組、UA組和CAP組中DEG熱圖。
（C） DEG的KEGG分析。
（D） FA組和CAP組中類固醇激素生物合成過程基因組的GSEA分析。
（E） 睪酮生物合成通路分子圖。
（F） 與類固醇生成和精子發(fā)生相關(guān)的DEGs熱圖。塊的顏色表示每組的基因表達(dá)水平。
（6）DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析，鑒定與PM2.5暴露相關(guān)的關(guān)鍵甲基化基因
圖7：WGBS和RNA-seq圖譜聯(lián)合分析揭示了PM2.5誘導(dǎo)的睪丸損傷中候選表觀遺傳基因和網(wǎng)絡(luò)失調(diào)
（A）與類固醇生物合成和精子發(fā)生相關(guān)的候選功能基因的啟動子甲基化和表達(dá)水平熱圖。（B） 參與生殖功能的候選基因網(wǎng)絡(luò)。
（C） RT-PCR驗(yàn)證睪丸中候選類固醇生成相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平（n=6）。
（D） RT-PCR驗(yàn)證睪丸中候選精子發(fā)生相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平（n=6）。
（E） Cyp11a1基因DMR內(nèi)代表性CpG甲基化譜。
（F） Pax8基因DMR內(nèi)代表性CpG甲基化譜。
（G） western blot分析睪丸候選基因的蛋白表達(dá)水平。
（H） CYP11A1和PAX8的蛋白質(zhì)定量分析（n=6）。
結(jié)論：
本研究表明PM2.5暴露可導(dǎo)致睪丸功能障礙，包括精子發(fā)生和類固醇激素功能障礙。作者揭示了PM2.5可以改變睪丸的甲基化水平，表明DNA甲基化可能參與PM2.5誘導(dǎo)的男性生殖損傷過程。睪丸全基因組DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析鑒定了與類固醇生成和精子發(fā)生過程相關(guān)的關(guān)鍵基因和通路，這可能是PM2.5導(dǎo)致男性生殖障礙的DNA甲基化調(diào)控機(jī)制。本研究可能為PM2.5誘導(dǎo)男性生殖毒性的潛在表觀遺傳機(jī)制提供重要信息和新視角。
參考文獻(xiàn)：Zhang Z, Wang J, Shi F, Li Y, Zou P, Tang Y, Liu C, Wang Y, Ling X, Sun L, Liu C, Zhang Y, Gao F, Chen Q, Ao L, Han F, Liu J, Cao J. Genome-wide alternation and effect of DNA methylation in the impairments of steroidogenesis and spermatogenesis after PM2.5 exposure. Environ Int. 2022 Sep 24;169:107544.
標(biāo)簽：
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