傷害性感覺神經(jīng)元廣泛支配脾臟并促進(jìn)生發(fā)中心反應(yīng)和體液免疫

當(dāng)人體暴露于有害刺激時，外周感覺神經(jīng)會檢測到這些刺激，并與免疫細(xì)胞積極合作，協(xié)同調(diào)節(jié)宿主防御。脾臟是最大的次級淋巴器官，也是體液免疫反應(yīng)的主要樞紐。然而，脾臟內(nèi)感覺神經(jīng)纖維的分布和功能仍不是太清楚。

傷害性感受器（nociceptor）是感覺神經(jīng)元中的一個主要亞群，特點是表達(dá)離子通道，通過感知各種有害刺激來保護(hù)生物體。值得注意的是，傷害性感覺神經(jīng)元在先天性免疫反應(yīng)中的免疫調(diào)節(jié)功能日益受到重視。這些神經(jīng)纖維會在局部釋放神經(jīng)肽，包括降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP），通過向免疫細(xì)胞或血管細(xì)胞傳遞信號來調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。不過，傷害性感覺神經(jīng)元在B細(xì)胞反應(yīng)和體液免疫中的潛在作用仍是個謎。

近日，軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院李慧艷、張宇程和周濤領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，傷害性感覺神經(jīng)元廣泛支配脾臟，并促進(jìn)生發(fā)中心（GC）反應(yīng)和體液免疫。這項研究成果于5月20日發(fā)表在頂級期刊《Cell》上，建立了一條通過背根神經(jīng)節(jié)-脾臟神經(jīng)連接調(diào)節(jié)體液免疫的途徑，有望通過靶向傷害性感覺神經(jīng)系統(tǒng)來提高宿主防御能力。
 

圖片來源：《Cell》
（https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.04.027）

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員構(gòu)建了多個小鼠模型來研究傷害性感覺神經(jīng)在脾臟中的潛在作用。例如，他們將Trpv1-Cre小鼠與Rosa26-LSL-DTR小鼠（賽業(yè)生物提供）交配，在注射白喉毒素后切除小鼠背根神經(jīng)節(jié)中的傷害性感覺神經(jīng)。他們還利用itdTomato⁺小鼠（賽業(yè)生物提供）來追蹤神經(jīng)元的位置。此外，研究人員還使用了Calcrl^fl/fl小鼠和Ramp1^-/-小鼠（由賽業(yè)生物提供）以研究脾臟生發(fā)中心反應(yīng)的分子機(jī)制。

技術(shù)路線
01 對傷害性感覺神經(jīng)元的標(biāo)志物CGRP進(jìn)行染色，觀察這些神經(jīng)在脾臟中的位置
02 通過神經(jīng)元示蹤劑追蹤到，傷害性感受器來源于左側(cè)T8-T13背根神經(jīng)節(jié)
03 通過多個小鼠模型探究傷害性感受器促進(jìn)生發(fā)中心反應(yīng)的分子機(jī)制
04 驗證辣椒素是否可激活傷害性感受器并增強(qiáng)抗病毒免疫力

研究結(jié)果
1. 傷害性感覺神經(jīng)元促進(jìn)脾臟生發(fā)中心反應(yīng)
為了確定脾臟是否受到傷害性感覺神經(jīng)元支配，研究人員采用了一種稱為SHANEL的組織透明化方法。在透明化后，對傷害性感覺神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物CGRP進(jìn)行染色，隨后進(jìn)行3D成像。他們興奮地觀察到，脾臟受CGRP⁺傷害性感覺神經(jīng)支配，這些神經(jīng)在脾臟內(nèi)形成復(fù)雜而廣泛的網(wǎng)絡(luò)。在進(jìn)一步分析后，他們發(fā)現(xiàn)傷害性感覺神經(jīng)深入脾臟實質(zhì)，并沿著血管到達(dá)B細(xì)胞區(qū)。

研究人員將Trpv1-Cre小鼠與Rosa26-LSL-DTR小鼠（iDTR，由賽業(yè)生物提供）交配產(chǎn)生了Trpv1-Cre⁺iDTR⁺小鼠，以便探究傷害性感覺神經(jīng)元在脾臟中的潛在作用。在注射白喉毒素（DT）后，小鼠背根神經(jīng)節(jié)和結(jié)狀神經(jīng)節(jié)中的TRPV1⁺傷害性感覺神經(jīng)元被有效切除。之后利用經(jīng)典的NP-KLH抗原對小鼠進(jìn)行免疫，以引發(fā)體液免疫反應(yīng)。他們發(fā)現(xiàn)，傷害性感受器缺失會導(dǎo)致小鼠生發(fā)中心B細(xì)胞、脾臟漿細(xì)胞以及NP特異性IgG抗體滴度顯著下降，表明傷害性感覺神經(jīng)元對脾臟生發(fā)中心反應(yīng)和體液免疫至關(guān)重要。

2. 支配脾臟的傷害性感受器來源于左側(cè)T8-T13背根神經(jīng)節(jié)
為了追蹤脾臟傷害性感覺神經(jīng)纖維的起源，研究人員在小鼠脾內(nèi)注射逆行神經(jīng)元示蹤劑——偽狂犬病毒（PRV）。他們發(fā)現(xiàn)，支配脾臟的傷害性感覺神經(jīng)元主要分布在背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)，而不是雙側(cè)結(jié)狀神經(jīng)節(jié)（圖1）。值得注意的是，這些細(xì)胞體主要位于脾臟同側(cè)的左側(cè)T8-T13背根神經(jīng)節(jié)。將順行示蹤劑AAV9-Trpv1-Cre病毒注射到itdTomato⁺小鼠（由賽業(yè)生物提供）左側(cè)T8-T13背根神經(jīng)節(jié)后，他們觀察到TRPV1-tdTomato⁺ CGRP⁺傷害性感覺神經(jīng)纖維支配脾臟（圖1）。這些數(shù)據(jù)表明，支配脾臟的傷害性感受器主要來源于左側(cè)T8-T13背根神經(jīng)節(jié)。
 

圖1 支配脾臟的傷害性感受器主要來源于左側(cè)T8-T13背根神經(jīng)節(jié)^[1]

那么，背根神經(jīng)節(jié)與脾臟的神經(jīng)連接是否會對脾臟生發(fā)中心反應(yīng)產(chǎn)生影響？研究人員發(fā)現(xiàn)，在切除小鼠左側(cè)T8-T13背根神經(jīng)節(jié)中的TRPV1⁺神經(jīng)元后，NP-KLH抗原誘導(dǎo)的生發(fā)中心B細(xì)胞、脾臟漿細(xì)胞以及NP特異性抗體顯著減少；但切除右側(cè)的對應(yīng)神經(jīng)元不會產(chǎn)生此類影響。此外，激活左側(cè)T8-T13背根神經(jīng)節(jié)中的傷害性感受器顯著增強(qiáng)了脾臟生發(fā)中心反應(yīng)。這些結(jié)果證實，來源于左側(cè)T8-T13背根神經(jīng)節(jié)的傷害性感覺神經(jīng)元在脾臟生發(fā)中心反應(yīng)和體液免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

3. CGRP受體CALCRL-RAMP1通過cAMP信號通路促進(jìn)生發(fā)中心反應(yīng)
支配內(nèi)臟器官的傷害性感受器可被駐留的微生物病原體及其產(chǎn)物直接激活。激活后，傷害性感受器的神經(jīng)末梢在局部釋放神經(jīng)肽（比如CGRP），然后直接作用于目標(biāo)細(xì)胞并調(diào)節(jié)下游生理功能。研究人員發(fā)現(xiàn)，NP-KLH抗原免疫后傷害性感受器的活性增強(qiáng)，進(jìn)而誘導(dǎo)脾臟內(nèi)CGRP的釋放。那么，炎癥介質(zhì)是否參與了傷害性感受器的激活？他們發(fā)現(xiàn)，抗原免疫導(dǎo)致前列腺素E2（PGE2）在脾臟中積累，且PGE2激活傷害性感受器以釋放CGRP。

接下來，他們評估了神經(jīng)肽CGRP對脾臟生發(fā)中心反應(yīng)的影響。在NP-KLH早期免疫過程中注射CGRP會促進(jìn)生發(fā)中心B細(xì)胞和脾臟漿細(xì)胞的產(chǎn)生，但在晚期免疫過程中注射則不然，表明CGRP在生發(fā)中心反應(yīng)的早期階段發(fā)揮重要作用。此外，對切除背根神經(jīng)節(jié)-脾臟神經(jīng)連接的小鼠，脾臟內(nèi)CGRP的水平顯著下降，但注射CGRP能挽救小鼠的生發(fā)中心反應(yīng)缺陷和NP特異性抗體水平。從這些結(jié)果可以看出，來源于背根神經(jīng)節(jié)傷害性感受器的神經(jīng)肽CGRP負(fù)責(zé)了脾臟生發(fā)中心反應(yīng)和體液免疫。

在探究背后機(jī)制時，研究人員發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞高水平表達(dá)CGRP的異源二聚體受體，特別是Calcrl和Ramp1。為此，他們將Calcrl^fl/fl小鼠（由賽業(yè)生物提供）與Cd19-Cre小鼠雜交，構(gòu)建出Cd19^Cre/+Calcrl^fl/fl小鼠，對B細(xì)胞中的Calcrl進(jìn)行條件性敲除。在NP-KLH免疫后，Cd19^Cre/+Calcrl^fl/fl小鼠的體液免疫反應(yīng)顯著減少。更重要的是，CGRP對脾臟生發(fā)中心反應(yīng)的促進(jìn)作用消失了（圖2）。在感染流感病毒PR8后，Cd19^Cre/+Calcrl^fl/fl小鼠體重減輕，且死亡率明顯增加。由此可見，B細(xì)胞上的CALCRL對于抗病毒感染的生發(fā)中心反應(yīng)和體液免疫至關(guān)重要。

為了進(jìn)一步驗證CGRP受體的作用，他們利用Ramp1^-/-小鼠（由賽業(yè)生物提供）和B細(xì)胞缺陷型（μMT）小鼠構(gòu)建骨髓嵌合體小鼠，這些小鼠的所有B細(xì)胞都缺乏Ramp1。在NP-KLH免疫后，Ramp1^-/-小鼠在生發(fā)中心反應(yīng)和體液免疫方面存在明顯的缺陷。他們還發(fā)現(xiàn)，CGRP刺激誘導(dǎo)了B細(xì)胞中cAMP的積累。利用腺苷酸環(huán)化酶（AC）激動劑處理Cd19^Cre/+Calcrl^fl/fl小鼠（以刺激cAMP產(chǎn)生）后，這些小鼠受損的生發(fā)中心反應(yīng)得以恢復(fù)（圖2）。這些結(jié)果表明，CGRP通過B細(xì)胞上的異源二聚體受體CALCRL-RAMP1激活cAMP信號通路，最終促進(jìn)脾臟生發(fā)中心反應(yīng)。
 

圖2 B細(xì)胞上的CGRP受體CALCRL-RAMP1促進(jìn)了生發(fā)中心反應(yīng)^[1]

4. 辣椒素激活傷害性感受器可增強(qiáng)抗流感免疫力
考慮到傷害性感受器在生發(fā)中心反應(yīng)中的作用，研究人員假設(shè)攝入辛辣食物（含有辣椒素）來激活傷害性感覺神經(jīng)有可能增強(qiáng)體液免疫。與假設(shè)一致，在喂食含辣椒素的飲食后，NP-KLH免疫小鼠的體液免疫反應(yīng)顯著增強(qiáng)。在切斷左側(cè)T8-T13背根神經(jīng)節(jié)的傷害性感受器后，辣椒素對脾臟生發(fā)中心反應(yīng)的增強(qiáng)效應(yīng)被阻斷。用辣椒素喂養(yǎng)的小鼠在感染流感病毒PR8后，病毒載量和肺部免疫細(xì)胞浸潤明顯減少；且辣椒素能夠有效防止小鼠體重下降，并顯著提高小鼠的存活率。這些結(jié)果表明，攝入辣椒素能夠增強(qiáng)病毒抗原誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)，并提高宿主對病毒感染的防御能力。

研究結(jié)論

圖3 傷害性感覺神經(jīng)元促進(jìn)生發(fā)中心反應(yīng)和體液免疫的示意圖^[1]

這項研究揭示了脾臟內(nèi)完整的傷害性感覺神經(jīng)纖維的3D結(jié)構(gòu)，并確定了背根神經(jīng)節(jié)-脾臟神經(jīng)連接在體液免疫中的關(guān)鍵作用。從機(jī)制上講，傷害性感受器產(chǎn)生的CGRP可通過B細(xì)胞上的異源二聚體受體CALCRL-RAMP1激活cAMP信號通路，從而促進(jìn)生發(fā)中心反應(yīng)并增強(qiáng)體液免疫（圖3）。

參考文獻(xiàn)：
[1]Wu M, Song G, Li J, et al. Innervation of nociceptor neurons in the spleen promotes germinal center responses and humoral immunity. Cell. 2024 May 15: S0092-8674(24)00453-7. https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.04.027

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C57BL/6JCya-Calcrl^em1/Cya
產(chǎn)品編號：
S-KO-10583
應(yīng)用方向：
神經(jīng)系統(tǒng),骨骼,心血管,血液,生理系統(tǒng),遺傳,腎臟
 

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產(chǎn)品編號：
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應(yīng)用方向：
神經(jīng)系統(tǒng),骨骼,心血管,血液,生理系統(tǒng),遺傳,腎臟
 

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產(chǎn)品編號：
S-KO-10276
應(yīng)用方向：
癌癥,骨骼,神經(jīng)元,遺傳
 

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品系名稱：
C57BL/6JCya-Ramp1^em1flox/Cya
產(chǎn)品編號：
S-CKO-11455
應(yīng)用方向：
癌癥,骨骼,神經(jīng)元,遺傳