JuLI™ Stage活細胞成像儀助力ROS研究，實時監(jiān)測細胞內(nèi)ROS的動態(tài)變化

在當(dāng)今的癌癥研究領(lǐng)域，ROS（活性氧）逐漸成為一個備受關(guān)注的熱點。ROS最初被視為細胞代謝的副產(chǎn)物，由于其具有破壞生物分子的潛力，故曾一度被認為是絕對有害的物質(zhì)。然而隨著研究的深入，ROS的重要性逐漸被揭示。它們在生物體的生存與健康中扮演著至關(guān)重要的角色，尤其是在癌癥發(fā)展和治療領(lǐng)域。

癌癥細胞由于代謝活動的旺盛，往往會產(chǎn)生較高水平的ROS。適量的ROS可以調(diào)節(jié)癌細胞的增殖與分化，但過高的ROS水平則可能引發(fā)細胞凋亡。這種雙重角色使得ROS在癌癥治療中具有獨特的潛力。近年來，研究發(fā)現(xiàn)影響腫瘤細胞和腫瘤微環(huán)境中免疫細胞代謝的新型氧化還原信號通路、令人關(guān)注的ROS對生物分子相分離的調(diào)控，以及新型抗癌藥物開發(fā)方面取得了新的研究進展。

ROS的活性化學(xué)性質(zhì)使其能夠快速修飾生物分子，導(dǎo)致生物分子的結(jié)構(gòu)、定位、分子間的相互作用和功能發(fā)生改變。ROS介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要發(fā)生在翻譯后水平，轉(zhuǎn)錄因子的氧化還原修飾和表觀遺傳學(xué)通過轉(zhuǎn)錄過程傳遞氧化還原信號。由于癌細胞中的ROS水平常常升高，ROS 介導(dǎo)的翻譯后修飾異常和表觀遺傳學(xué)變化可能會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因突變。這些變化還會影響腫瘤微環(huán)境（TME）中癌細胞與免疫細胞之間的相互作用，從而導(dǎo)致炎癥和惡病質(zhì)。

圖1 ROS 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)過程、與新陳代謝的相互影響以及對腫瘤微環(huán)境和免疫功能的影響

ROS對免疫系統(tǒng)的影響是多維且存在濃度依賴性的，其在本質(zhì)上可以是促進或抑制的。全面了解ROS對免疫細胞的分級劑量效應(yīng)對于制定有效的策略以改善癌癥免疫治療至關(guān)重要。ROS的適度增加可促進免疫細胞的多種功能，包括細胞因子等效應(yīng)物的代謝、合成和分泌。ROS還為免疫細胞，如M2巨噬細胞（Mφ）、骨髓源性抑制細胞（MDSCs）和調(diào)節(jié)性T細胞（Treg細胞）提供了選擇，因為它們具有較高的抗氧化能力，而嚴重的ROS應(yīng)激可能會導(dǎo)致免疫細胞的死亡。

圖2 ROS 對癌癥和免疫細胞功能的分級劑量效應(yīng)

在ROS應(yīng)激期間，細胞中經(jīng)常觀察到由易相分離蛋白形成的無膜細胞器，在這些細胞中，具有特定功能的蛋白質(zhì)/酶和底物同時集中，以高效地促進某些生化過程。ROS可通過多種途徑調(diào)節(jié)相分離：①通過ROS介導(dǎo)的PTM發(fā)生相分離；②p62/Sequestosome-1 (SQSTM1) 與泛素化蛋白結(jié)合并發(fā)生相分離；③ROS誘導(dǎo)應(yīng)激顆粒（SG）形成，以防止翻譯從而減少氧化應(yīng)激下錯誤折疊蛋白的積累；④脂滴可從細胞膜中吸收多不飽和脂肪酸，防止細胞膜過氧化；⑤癌細胞可能通過形成 G 體來提高糖酵解效率。

圖3 ROS在相分離中的作用

圖4 ROS在誘導(dǎo)調(diào)節(jié)細胞死亡中的作用

氧化還原穩(wěn)態(tài)對于癌細胞、癌癥干細胞、癌癥相關(guān)成纖維細胞和腫瘤微環(huán)境中的其他細胞的生存至關(guān)重要。破壞ROS產(chǎn)生和消除之間的平衡將對癌細胞的存活和藥物敏感性產(chǎn)生重大影響。氧化還原調(diào)節(jié)的治療策略包括①靶向抑制或激活ROS的生成和②抑制或重新激活氧化還原適應(yīng)。除了針對細胞內(nèi)氧化還原平衡，還有其他針對ROS的治療策略，如光動力療法和光熱療法可誘導(dǎo)ER應(yīng)激、ROS生成和癌細胞死亡。

ROS作為細胞代謝過程中的重要產(chǎn)物，具有雙重功能。適量的ROS在細胞信號傳導(dǎo)、免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要作用，而過量的ROS則會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進而引發(fā)多種疾病。以癌癥中的 ROS 為靶點是一種前景廣闊的治療策略，同時也帶來了新的機遇和挑戰(zhàn)。JuLI™ Stage活細胞成像分析系統(tǒng)在活性氧應(yīng)用中發(fā)揮重要作用，它能夠動態(tài)觀察和實時監(jiān)測細胞內(nèi)ROS的變化過程，使得研究人員能夠在更接近生理條件的環(huán)境下觀察細胞行為，從而獲得更準確、更全面的實驗結(jié)果。

蘇州奎克泰生物的JuLI™ Stage活細胞成像分析系統(tǒng)，是一款能夠長時間放在培養(yǎng)箱內(nèi)，無需反復(fù)取出即可實時監(jiān)測和分析細胞生長過程的成像設(shè)備。JuLI™ Stage活細胞成像分析系統(tǒng)配備明場和三色熒光（GFP、RFP、DAPI），具有全自動X-Y-Z軸、自動聚焦和手動聚焦、圖像拼接等功能，配備各種分析軟件，能夠批量計算細胞數(shù)量、大小、面積、熒光強度等。

仁荷大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)系研究人員于2020年在《International Journal of Molecular Sciences》期刊發(fā)表名為“Adenosine Triphosphate Accumulated Following Cerebral Ischemia Induces Neutrophil Extracellular Trap Formation”的文章。在這篇文章中，研究者探討了腦缺血后釋放的細胞外 ATP 是否會誘導(dǎo)中性粒細胞的炎性細胞死亡方式（NETosis），以及其潛在的分子機制和信號通路是什么。
 

文章中檢測Ca²⁺水平，使用 Fluo-4-AM 測量血液中性粒細胞內(nèi) Ca²⁺水平。將細胞與4 µM的Fluo-4-AM 共孵育15 分鐘，用 HBSS洗滌后進行細胞接種，使用JuLI™ Stage監(jiān)測Fluo-4-AM熒光強度變化，后與ImageJ聯(lián)用對熒光數(shù)據(jù)進行定量分析。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)BzATP 處理過的血液中性粒細胞內(nèi)的Ca²⁺水平顯著升高，而使用 A438079（10 µM）或BAPTA-AM （10 µM）預(yù)處理細胞后，Ca²⁺水平明顯降低。

研究者還將血液嗜中性粒細胞或bm-嗜中性粒細胞在含有1µM 的CM-H2DCFDA（一種通用的ROS指示劑）中孵育30 min。用PBS洗滌細胞兩次，使用JuLI™ Stage活細胞成像分析系統(tǒng)觀察熒光圖像。獲得圖像結(jié)果后與ImageJ聯(lián)用對熒光數(shù)據(jù)進行定量分析。實驗結(jié)果表明使用CM-H2DCFDA檢測ROS的產(chǎn)生時，發(fā)現(xiàn)ATP處理細胞2h后血液中性粒細胞的CM-H2DCFDA熒光強度顯著增加， 但在 A438079（10 μM）、BAPTA-AM（10 μM）或 Gö6983 （10 μM）預(yù)處理細胞20min 發(fā)現(xiàn)CM-H2DCFDA 的熒光強度被明顯抑制，表明ATP以P2X7R-、Ca²⁺-和PKC依賴的方式誘導(dǎo)血液中性粒細胞產(chǎn)生ROS。
 

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[1]Glorieux C, Liu S, Trachootham D, Huang P. Targeting ROS in cancer: rationale and strategies. Nat Rev Drug Discov. 2024 Aug;23(8):583-606.

[2]Kim SW, Davaanyam D, Seol SI, Lee HK, Lee H, Lee JK. Adenosine Triphosphate Accumulated Following Cerebral Ischemia Induces Neutrophil Extracellular Trap Formation. Int J Mol Sci. 2020 Oct 16;21(20):7668.